معلومة

طرق لمراقبة حركية الإنزيم بدقة زمنية سريعة جدًا؟

طرق لمراقبة حركية الإنزيم بدقة زمنية سريعة جدًا؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا مهتم بأي طريقة للقيام بدراسة محددة زمنياً لحركية الإنزيم. أنا أدرس بعض المتغيرات الفيزيائية التي قد تؤثر على الخواص الحركية ، لكنني أرغب في دراسة مدى سرعة تأثيرها ، ومدة استمرار التأثير. النطاق الزمني للفائدة هو ملي ثانية أو أقل ، لذلك لن تعمل طرق القياس الطيفي النموذجية (التي تنظر عادةً إلى تغير الامتصاص على مدى أوقات طويلة إلى حد ما في حدود الدقائق).

يمكن مراقبة نشاط Luciferase عن طريق تتبع الضوء المنبعث ، ومن المحتمل أن يكون لهذا دقة زمنية عالية جدًا حيث أن الوقت بين التفاعل وانبعاث الضوء يكون في حدود ميكروثانية. ومع ذلك ، فإن لوسيفيراز هو نموذج غريب بعض الشيء ، لأنه ليس جزءًا من التمثيل الغذائي الطبيعي أو الإشارات في معظم الكائنات الحية.

هل هناك طريقة لتتبع حركية الإنزيم لأي إنزيمات أخرى ذات دقة زمنية سريعة مماثلة؟

تعديل اكتشفت للتو اسمًا واحدًا لما أبحث عنه: "الحركية العابرة".


يمكن لبعض ATPases العمل مع MANT-ATP أو نظائر ATP الفلورية المماثلة التي تغير خصائص التألق عند ارتباط البروتين وكذلك التحلل المائي لمجموعة الفوسفات الخاصة بهم. تم استخدام هذا بشكل متكرر (انظر هنا أو هنا) لدراسة حركية الإنزيم على جداول زمنية سريعة.


خدمة فحص نشاط الإنزيم

فحوصات نشاط الإنزيم هي طرق معملية لقياس النشاط الأنزيمي. وهي ضرورية لدراسة حركية الإنزيم وتثبيط الإنزيم.

وحدات الانزيم: يمكن التعبير عن كميات الإنزيمات كمقادير مولارية ، كما هو الحال مع أي مادة كيميائية أخرى ، أو قياسها من حيث النشاط ، في وحدات الإنزيم.

يوفر Medicilon مختلف فحوصات نشاط الإنزيم للكينازات ، الفوسفاتيز ، البروتينات ، ديسيتيلاز ، ببتيداز ، إستراز ، وغيرها من الإنزيمات. يضمن خطنا من المقايسات المناعية والأطقم البيوكيميائية المميزة نتائج دقيقة وقابلة للتكرار.

الإنزيم هو فئة كبيرة من الجزيئات الحيوية التي تحفز العمليات البيولوجية المختلفة بما في ذلك عمليات التمثيل الغذائي ، والإشارات الخلوية والتنظيم ، وانقسام الخلايا والاستماتة. تقوم التفاعلات الأنزيمية بتحويل جزيئات الركيزة إلى منتجات جزيئات معدلة كيميائيًا بدقة ودقة عالية. تشمل هذه التعديلات الهضم التحلل للبروتين ، التحلل الجلوكوز ، الفسفرة ، الأسيلة ، الارتباط بالجليكوزيل أو عمليات الأكسدة والاختزال.

لدينا عقود من الخبرة في تصميم وتصنيع الانزيمات النشطة وتدعم ركائزها تطوير محفظة دائمة التوسع من فحوصات الكيمياء الحيوية. نحن نقدم خدمات على المقايسات الأنزيمية لمساعدة العلماء الذين يركزون على أبحاث كيناز:

  • التقييم الحركي لنشاط الإنزيم والتثبيط
  • فحص المانع والتحقق من صحته
  • IC50 تحديد المركبات الدوائية
  • دراسات مثبطات الإنزيم لتحليل طريقة العمل
  • تحقيقات حول قابلية عكس تثبيط الإنزيم
  • التنميط الركيزة تحليل انتقائية الإنزيمات

لنا فحوصات نشاط الإنزيم تتضمن الالتقاط المناعي للبروتين المعني أولاً متبوعًا بقياس الركيزة أو معدل دوران المنتج. تستخدم هذه الأجسام المضادة وحيدة النسيلة فقط التي تم فحصها لعزل الإنزيم في شكل نشط وفي المجمعات التي من المحتمل أن تمثل ارتباطاتها في الموقع. هناك العديد من المزايا. يتم فصل الإنزيم عن البروتينات الأخرى التي تستخدم أو تنتج نفس الركائز أو المنتجات التي تم فحصها وهذا يسمح بإجراء فحوصات بسيطة مثل استخدام ATP و NADH والبيروفات وما إلى ذلك ، والتي تخضع لتفاعلات متعددة في الجسم الحي. بالنسبة لمعظم الإنزيمات التي لدينا مجموعات فحص نشاط لها ، فإننا نقدم أيضًا ساندويتش فحوصات ELISA من الكمية. من خلال الجمع بين الاثنين ، من الممكن توليد بيانات أنشطة محددة. علاوة على ذلك ، نظرًا لفصل الإنزيم عن المكونات الخلوية الأخرى ، يمكن قياس التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) التي يحتوي عليها وقت الفحص ، على سبيل المثال. عن طريق قياس الطيف الكتلي اللاحق أو التفاعل مع الأجسام المضادة المحددة لـ PTM.

طريقة فحص الانزيم

  • طرق قياس الطيف الضوئي
  • طرق الإسفار
  • طرق أخذ العينات
  • طرق القياس
  • طرق Eletrode
  • طريقة الاستقطاب

أنواع الفحص

الجميع فحوصات الإنزيم قياس استهلاك الركيزة أو إنتاج المنتج بمرور الوقت. يوجد عدد كبير من الطرق المختلفة لقياس تركيزات الركائز والمنتجات ويمكن اختبار العديد من الإنزيمات بعدة طرق مختلفة. يدرس علماء الكيمياء الحيوية عادةً التفاعلات المحفزة بالإنزيم باستخدام أربعة أنواع من التجارب:

(1) تجارب المعدل الأولي

عندما يتم خلط إنزيم مع فائض كبير من الركيزة ، تتراكم المادة الوسيطة للركيزة الإنزيمية في عابر أولي سريع. ثم يحقق التفاعل حركية الحالة المستقرة حيث تظل مواد الركيزة الإنزيمية ثابتة تقريبًا بمرور الوقت ويتغير معدل التفاعل ببطء نسبيًا. تُقاس المعدلات لفترة قصيرة بعد بلوغ حالة شبه ثابتة ، عادةً عن طريق مراقبة تراكم المنتج بمرور الوقت. نظرًا لأن القياسات يتم إجراؤها لفترة قصيرة جدًا وبسبب الزيادة الكبيرة في الركيزة ، يمكن إجراء الركيزة الحرة التقريبية تقريبًا مساوية للركيزة الأولية. تجربة المعدل الأولي هي الأبسط من حيث الأداء والتحليل ، فهي خالية نسبيًا من المضاعفات مثل رد الفعل العكسي وتدهور الإنزيم. لذلك فهو إلى حد بعيد النوع الأكثر استخدامًا من التجارب في حركية الإنزيم.

(2) تجارب منحنى التقدم

في هذه التجارب ، يتم تحديد المعلمات الحركية من تعبيرات لتركيزات الأنواع كدالة للوقت. يتم تسجيل تركيز الركيزة أو المنتج في الوقت المناسب بعد الانتقال السريع الأولي ولمدة طويلة بما يكفي للسماح للتفاعل بالاقتراب من التوازن. نلاحظ بالمرور أنه على الرغم من أنها أقل شيوعًا الآن ، فقد تم استخدام تجارب منحنى التقدم على نطاق واسع في الفترة المبكرة من حركية الإنزيم.

(3) تجارب الخواص الحركية العابرة

في هذه التجارب ، يتم تتبع سلوك التفاعل خلال الفترة الانتقالية السريعة الأولية حيث يصل الوسيط إلى فترة الخواص الحركية للحالة المستقرة. هذه التجارب أكثر صعوبة في الأداء من أي من الفئتين المذكورتين أعلاه لأنها تتطلب خلطًا سريعًا وتقنيات المراقبة.

في هذه التجارب ، يتم اضطراب خليط التوازن من الإنزيم والركيزة والمنتج ، على سبيل المثال بسبب درجة الحرارة أو الضغط أو قفزة الأس الهيدروجيني ، ويتم مراقبة العودة إلى التوازن. يتطلب تحليل هذه التجارب النظر في رد الفعل القابل للانعكاس بالكامل. علاوة على ذلك ، فإن تجارب الاسترخاء غير حساسة نسبيًا للتفاصيل الميكانيكية وبالتالي لا تُستخدم عادةً لتحديد الآلية ، على الرغم من أنها يمكن أن تكون في ظل ظروف مناسبة.

اتصل بنا

نصائح: أعلاه جزء من خدمة فحص نشاط الإنزيم وطرق فحص الإنزيم. يمكنك أيضًا الاتصال بنا إذا كان لديك أي سؤال أو استفسار. سنكون سعداء لمناقشة احتياجاتك بالتفصيل وتصميم خطة عمل مناسبة.


محتويات

يعتمد التحليل الحركي لتقدم التفاعل على القدرة على مراقبة تحويل التفاعل بدقة بمرور الوقت. يمكن تحقيق هذا الهدف من خلال مجموعة من التقنيات ، وأكثرها شيوعًا موصوفة أدناه. بينما يتم تصنيف هذه التقنيات في بعض الأحيان على أنها تفاضلية (مراقبة معدل التفاعل بمرور الوقت) أو متكاملة (مراقبة كمية الركيزة و / أو المنتج بمرور الوقت) ، فإن التلاعب الرياضي البسيط (التمايز أو التكامل) يسمح بتحويل البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة أي من الاثنين . بغض النظر عن التقنية المطبقة ، من المفيد بشكل عام تأكيد الصلاحية في نظام الفائدة من خلال المراقبة بطريقة مستقلة إضافية. [2]

تقدم رد الفعل تحرير NMR

غالبًا ما يكون التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي هو الطريقة المفضلة لرصد تقدم التفاعل ، حيث يمكن ملاحظة استهلاك الركيزة و / أو تكوين المنتج بمرور الوقت من تغيير ذروة التكامل بالنسبة لمعيار غير تفاعلي. من بيانات التركيز ، يمكن الحصول على معدل التفاعل بمرور الوقت عن طريق أخذ مشتق توافق متعدد الحدود إلى المنحنى التجريبي. [3] يمكن تصنيف تقدم التفاعل بالرنين المغناطيسي النووي على أنه تقنية متكاملة حيث أن البيانات الأولية التي يتم جمعها تتناسب مع التركيز مقابل الوقت. [2] في حين أن هذه التقنية ملائمة للغاية للأنظمة المحددة بوضوح ذات المنتج المميز و / أو القمم المتفاعلة ، إلا أن لها عيبًا في طلب نظام متجانس قابل للتفاعل في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. في حين أن مراقبة الرنين المغناطيسي النووي قد تسمح بتحديد وسيط التفاعل ، فإن وجود أي نوع معين على مدار التفاعل لا يعني بالضرورة أنه ينطوي على عملية إنتاجية. [1] تقدم التفاعل يمكن تشغيل الرنين المغناطيسي النووي في كثير من الأحيان في درجات حرارة متغيرة ، مما يسمح بتعديل معدل التفاعل إلى مستوى مناسب للملاحظة. تكثر الأمثلة على الاستفادة من تقدم التفاعل بالرنين المغناطيسي النووي ، مع أمثلة بارزة بما في ذلك التحقيق في Buchwald-Hartwig amination (قد يلاحظ المرء أن النقاش الكبير حول أفضل نهج للتطوير الميكانيكي لأسلوب Buchwald-Hartwig كما يتضح من عدد من التقارير المتناقضة والمتنافسة المنشورة خلال فترة زمنية قصيرة. راجع المقالة المحددة والمراجع الواردة فيها.) [4]

فى الموقع تحرير FT-IR

فى الموقع يمكن استخدام التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لمراقبة مسار التفاعل ، بشرط أن يُظهر الكاشف أو المنتج امتصاصًا مميزًا في المنطقة الطيفية للأشعة تحت الحمراء. يمكن استخلاص معدل استهلاك المادة المتفاعلة و / أو تكوين المنتج من تغير الامتصاص بمرور الوقت (عن طريق تطبيق قانون بيرز). حتى عندما تعرض أطياف المواد المتفاعلة والمنتج درجة معينة من التداخل ، فإن برامج الأجهزة الحديثة قادرة بشكل عام على تفكيك المساهمات النسبية بدقة بشرط أن يكون هناك تغيير جذري في الامتصاص المطلق لقمة الاهتمام بمرور الوقت. فى الموقع يمكن تصنيف IR على أنها تقنية متكاملة حيث أن البيانات الأولية التي تم جمعها تتناسب مع التركيز مقابل الوقت. [2] من هذه البيانات ، يمكن الحصول على مادة البداية أو تركيز المنتج بمرور الوقت ببساطة عن طريق أخذ تكامل التوافق متعدد الحدود مع المنحنى التجريبي. [3] مع زيادة توافر أجهزة قياس الطيف مع فى الموقع قدرات المراقبة ، شهدت FT-IR استخدامًا متزايدًا في السنوات الأخيرة. تشمل الأمثلة على الملاحظة التحليل الميكانيكي لتخليق Strecker غير المتماثل المحفز من amido-thiourea للأحماض الأمينية غير الطبيعية ولتحفيز هالولاكتون و cycloetherification المحفز بقاعدة لويس. [5] [6]

فى الموقع تحرير الأشعة فوق البنفسجية

بشكل مشابه إلى فى الموقع تجارب الأشعة تحت الحمراء الموصوفة أعلاه ، فى الموقع يمكن استخدام التحليل الطيفي للامتصاص المرئي للأشعة فوق البنفسجية لمراقبة مسار التفاعل ، بشرط أن يظهر الكاشف أو المنتج امتصاصًا مميزًا في المنطقة الطيفية للأشعة فوق البنفسجية. يمكن استخلاص معدل استهلاك المادة المتفاعلة و / أو تكوين المنتج من تغير الامتصاص بمرور الوقت (من خلال تطبيق قانون بير) ، مما يؤدي مرة أخرى إلى التصنيف كأسلوب متكامل. [2] نظرًا للمنطقة الطيفية المستخدمة ، تُستخدم تقنيات UV-vis بشكل أكثر شيوعًا في الأنظمة غير العضوية أو المعدنية العضوية منها في التفاعلات العضوية البحتة ، وتشمل الأمثلة استكشاف تفاعل السماريوم باربييه. [7]

رد فعل كالوري تحرير

يمكن استخدام قياس المسعرات لمراقبة مسار التفاعل ، حيث تتم مراقبة التدفق الحراري الفوري للتفاعل ، والذي يرتبط ارتباطًا مباشرًا بتغيير المحتوى الحراري للتفاعل. يمكن تصنيف كالوريمتر التفاعل كتقنية تفاضلية لأن البيانات الأولية التي تم جمعها تتناسب مع المعدل مقابل الوقت. من هذه البيانات ، يمكن الحصول على مادة البداية أو تركيز المنتج بمرور الوقت ببساطة عن طريق أخذ تكامل التوافق متعدد الحدود مع المنحنى التجريبي. [2] [8] [9] بينما يتم استخدام مقياس كالوري التفاعل بشكل أقل تكرارًا من عدد من التقنيات الأخرى ، فقد وجد استخدامه كأداة فعالة لفحص المحفز. [10] تم أيضًا تطبيق مقياس مسعر التفاعل كطريقة فعالة للدراسة الآلية للتفاعلات الفردية بما في ذلك أمين ألفا المحفز بالبرولين للألدهيدات [11] وتفاعل بوخوالد-هارتويج المحفز بالبلاديوم. [4] [12]

مزيد من التقنيات تحرير

في حين أن كروماتوغرافيا الغاز ، و HPLC ، وقياس الطيف الكتلي كلها تقنيات ممتازة لتمييز خلائط المركبات (وأحيانًا حتى المتشابهة) ، فإن دقة الوقت لهذه القياسات أقل دقة من التقنيات الموضحة أعلاه. بغض النظر ، لا تزال هذه التقنيات تُستخدم ، كما هو الحال في التحقيق في تفاعل Heck حيث حالت الطبيعة غير المتجانسة للتفاعل دون استخدام التقنيات الموضحة أعلاه. [13] وتنشيط سومو بواسطة المحفزات العضوية [14] على الرغم من أوجه القصور فيها ، قد تعمل هذه التقنيات كطرق معايرة ممتازة.

غالبًا ما يتم تقديم بيانات تقدم التفاعل ببساطة كمؤامرة لتركيز الركيزة ([A]ر) مقابل الوقت (ر) أو تحويل الكسر (F) مقابل الوقت (ر). يتطلب الأخير معالجة جبرية طفيفة لتحويل قيم التركيز / الامتصاصية إلى تحويل كسري (F)، بواسطة:

اين ا]0 هي كمية أو امتصاص أو تركيز الركيزة الموجودة في البداية و [A]ر هي كمية أو امتصاص أو تركيز هذا الكاشف في الوقت المناسب ، ر. قد يكون تطبيع البيانات لتحويل كسري مفيدًا بشكل خاص لأنه يسمح بتشغيل تفاعلات متعددة بكميات أو تركيزات مطلقة مختلفة ليتم مقارنتها في نفس المؤامرة.

يمكن أيضًا تقديم البيانات بشكل شائع كمؤامرة لمعدل التفاعل (الخامس) مقابل الوقت (ر). مرة أخرى ، يلزم إجراء معالجة جبرية بسيطة على سبيل المثال ، تعطي تجارب المسعرات:

أين ف هو النقل الفوري للحرارة ، Δح هو التغير المعروف في المحتوى الحراري للتفاعل ، و الخامس هو حجم التفاعل. [2]

غالبًا ما يتم تقديم البيانات المستمدة من تجارب الخواص الحركية لتقدم التفاعل عبر معدل (الخامس) مقابل تركيز الركيزة ([S]) مؤامرة. هذا يتطلب الحصول على والجمع بين كل من [S] مقابل. ر و ال الخامس ضد. ر المخططات الموضحة أعلاه (لاحظ أنه يمكن الحصول على إحداها من الأخرى عن طريق التمايز أو التكامل البسيط.) يؤدي الجمع إلى مجموعة قياسية من المنحنيات يتم فيها قراءة تقدم التفاعل من اليمين إلى اليسار على طول x- يتم قراءة المحور ومعدل التفاعل من أسفل إلى أعلى على طول ذ-محور. [2] بينما تقدم هذه المخططات غالبًا عرضًا مرئيًا مقنعًا للاتجاهات الحركية الأساسية ، إلا أن الطرق التفاضلية تتفوق عمومًا في استخراج ثوابت المعدل العددي. (انظر أدناه)

في الحركية التحفيزية ، هناك تقريبان أساسيان مفيدان (في ظروف مختلفة) لوصف سلوك العديد من الأنظمة. يمكن تمييز الحالات التي تكون فيها التقريبات السابقة للتوازن والحالة المستقرة صالحة غالبًا عن طريق التحليل الحركي لتقدم التفاعل ، وترتبط الحالتان ارتباطًا وثيقًا بحالة السكون للمحفز.

تقريب الحالة المستقرة تحرير

في ظل ظروف الحالة المستقرة ، يخضع المحفز والركيزة إلى ارتباط قابل للانعكاس يتبعه استهلاك سريع نسبيًا لمركب المحفز - الركيزة (عن طريق كل من التفاعلات الأمامية إلى المنتج وردود الفعل العكسية على المحفز غير المرتبط.) يشير تقريب الحالة المستقرة إلى أن تركيز لا يتغير مركب الركيزة المحفز بمرور الوقت ، حيث يظل التركيز الكلي لهذا المركب منخفضًا حيث يتم تحريكه بعيدًا على الفور تقريبًا بعد التكوين. [15] يحتوي قانون معدل الحالة المستقرة على جميع ثوابت المعدل والأنواع المطلوبة للانتقال من مادة البداية إلى المنتج ، بينما يتكون المقام من مجموع المصطلحات التي تصف المعدلات النسبية للتفاعلات الأمامية والعكسية التي تستهلك الحالة الثابتة متوسط. لأبسط حالة حيث تنتقل ركيزة واحدة إلى منتج واحد من خلال وسيط واحد:

في موقف أكثر تعقيدًا بعض الشيء حيث ترتبط ركيزتان بالتسلسل متبوعًا بإصدار المنتج:

يمكن وصف الأنظمة المعقدة بشكل متزايد ببساطة باستخدام الخوارزمية الموضحة في هذا المرجع. [16]

في حالة ظروف الحالة المستقرة الموصوفة أعلاه ، تكون حالة راحة المحفز هي الشكل غير المرتبط (لأن الوسيط المرتبط بالركيزة ، بحكم التعريف ، موجود فقط عند الحد الأدنى من التركيز.) [17]

تعديل تقريب ما قبل التوازن

في ظل ظروف ما قبل التوازن ، يخضع المحفز والركيزة إلى ارتباط سريع وقابل للعكس قبل خطوة بطيئة نسبيًا تؤدي إلى تكوين المنتج وإطلاقه. في ظل هذه الظروف ، يمكن وصف النظام بقانون معدل "واحد زائد" حيث يتكون البسط من جميع ثوابت المعدل والأنواع المطلوبة للانتقال من مادة البداية إلى المنتج ، ويتكون المقام من مجموع المصطلحات التي تصف كل من الحالات التي يوجد فيها المحفز (و 1 يتوافق مع المحفز الحر). [18] لأبسط حالة حيث تنتقل ركيزة واحدة إلى منتج واحد من خلال وسيط واحد:

في الموقف الأكثر تعقيدًا بعض الشيء حيث ترتبط ركيزتان بالتسلسل متبوعًا بإصدار المنتج:

في حالة ظروف التوازن المسبق البسيطة الموضحة أعلاه ، تكون حالة راحة المحفز إما كليًا أو جزئيًا (اعتمادًا على حجم ثابت التوازن) معقد مرتبط بالركيزة.

حركية التشبع تحرير

يمكن النظر إلى ظروف التشبع كحالة خاصة لظروف ما قبل التوازن. عند تركيز الركيزة التي تم فحصها ، يكون تكوين مركب الركيزة المحفز سريعًا ولا رجوع فيه بشكل أساسي. [19] تتكون حالة راحة المحفز بالكامل من المركب المرتبط ، و [أ] لم يعد موجودًا في قانون المعدل المتغير [أ] لن يكون له أي تأثير على معدل التفاعل لأن المحفز مرتبط تمامًا بالفعل ويتفاعل بالسرعة نفسها ك2 يسمح. أبسط حالة من حركية التشبع هي نموذج Michaelis-Menten المدروس جيدًا لحركية الإنزيم.

التغييرات في حالة راحة المحفز تحرير

في حين أن التفاعل قد يُظهر مجموعة واحدة من السلوك الحركي في التحويل المبكر ، فقد يتغير هذا السلوك بسبب:

  • التغييرات في حالة راحة المحفز تتأثر بتغيير تركيزات الركيزة
  • آليات متعددة أو متغيرة تتأثر بتركيزات الركيزة أو المنتج
  • تنشيط المحفز (فترة بدء)
  • تثبيط المنتج
  • موت محفز لا رجعة فيه (أو قابل للعكس)

في حالة حركية التشبع الموصوفة أعلاه ، بشرط عدم وجود [A] في فائض كبير بالنسبة إلى [B] ، فإن شروط التشبع ستطبق فقط في بداية التفاعل. مع استهلاك الركيزة ، ينخفض ​​التركيز ، وفي النهاية لم يعد [A] كافيًا للتغلب على [Cat] تمامًا. يتجلى هذا من خلال التغيير التدريجي في المعدل من 0 ترتيب إلى ترتيب أعلى (أي الأول ، الثاني ، إلخ) في الترتيب [A]. يمكن أيضًا وصف هذا على أنه تغيير في حالة استراحة المحفز من الشكل المرتبط إلى الشكل غير المنضم على مدار التفاعل.

بالإضافة إلى إبطاء التفاعل ببساطة ، قد يؤدي التغيير في حالة راحة المحفز على مدار التفاعل إلى مسارات أو عمليات متنافسة. قد توجد آليات متعددة للوصول إلى المنتج ، وفي هذه الحالة قد يتغير الترتيب في المحفز أو الركيزة اعتمادًا على الظروف أو النقطة في التفاعل. يتضمن المسبار المفيد بشكل خاص للتغييرات في آلية التفاعل فحص معدل التفاعل الطبيعي مقابل تحميل المحفز عند نقاط تحويل متعددة وثابتة. لاحظ أن معدل التفاعل الطبيعي:

يضبط لاستهلاك الركيزة على مدار التفاعل ، لذلك سيتم ملاحظة تغيرات المعدل فقط بسبب تحميل المحفز. إن الاعتماد الخطي على تحميل المحفز لتحويل معين يدل على اعتماد من الدرجة الأولى على المحفز في هذا التحويل ، ويمكن للمرء أن يتخيل بالمثل المخططات غير الخطية الناتجة عن اعتماد الترتيب الأعلى. تشير التغييرات في الخطية أو اللاخطية من مجموعة واحدة من نقاط التحويل إلى أخرى إلى التغيرات في الاعتماد على المحفز خلال مسار التفاعل. على العكس من ذلك ، فإن التغييرات في الخطية أو اللاخطية لمناطق قطعة الأرض المحفوظة عبر نقاط تحويل متعددة (أي عند 30 و 50 و 70٪) تشير إلى تغيير في الاعتماد على المحفز بناءً على تركيز المحفز المطلق.

يمكن أن تؤدي تفاعلات المحفز مع مكونات متعددة لخليط التفاعل إلى اعتماد حركي معقد. بينما تعتبر تفاعلات المحفز - الركيزة خارج الدورة أو تفاعلات المحفز - المنتج عمومًا "سامة" للنظام (وبالتأكيد الحالة في حالة التعقيد الذي لا رجعة فيه) توجد حالات تحمي فيها الأنواع خارج الدورة فعليًا المحفز من التعطيل الدائم. [21] [22] في كلتا الحالتين ، غالبًا ما يكون من الضروري فهم دور حالة السكون المحفز. [3] [11]

المعلمة المتغيرة الأكثر أهمية في التحليل الحركي لتقدم التفاعل هي الزيادة (ه) ركيزة على أخرى ، معطاة بوحدات المولارية. يمكن تحديد التركيزات الأولية لنوعين في التفاعل من خلال:

وبافتراض قياس كائنات تفاعل واحد لواحد ، يتم الاحتفاظ بكمية الزيادة في إحدى الركائز على الأخرى على مدار التفاعل بالكامل بحيث: [3]

يمكن إنشاء مجموعة مماثلة للتفاعلات ذات القياس المتكافئ ذو الترتيب الأعلى وفي هذه الحالة يتغير الفائض بشكل متوقع على مدار التفاعل. في حين ه يمكن أن تكون أي قيمة (موجبة أو سالبة أو صفرية) بشكل عام قيم موجبة أو سالبة أصغر من حيث الحجم من مكافئ واحد من الركيزة المستخدمة في التحليل الحركي لتقدم التفاعل. (قد يلاحظ المرء أن حركية الترتيب الزائف الصفري تستخدم قيمًا زائدة أكبر بكثير في الحجم من المكافئ الوحيد للركيزة).

تحديد معامل الفائض (ه) يسمح ببناء نفس التجارب الزائدة التي يتم فيها تشغيلان أو أكثر من تجربة حركية بتركيزات أولية مختلفة ، ولكن نفس الزيادة تسمح بدخول التفاعل بشكل مصطنع في أي نقطة. تعتبر هذه التجارب حاسمة بالنسبة لـ RPKA للتفاعلات التحفيزية ، لأنها تمكن المرء من التحقيق في عدد من الاحتمالات الميكانيكية بما في ذلك تنشيط المحفز (فترات الحث) ، وإلغاء تنشيط المحفز ، وتثبيط المنتج الموصوف بمزيد من التفصيل أدناه. [2] [3]

تحديد تردد دوران المحفز تحرير

قبل إجراء مزيد من الاستقصاء الآلي ، من المهم تحديد الاعتماد الحركي لتفاعل الاهتمام على المحفز. يمكن التعبير عن تردد الدوران (TOF) للمحفز كمعدل رد فعل طبيعي لتركيز المحفز:

يتم تحديد TOF هذا عن طريق تشغيل أي تجربتين أو أكثر من التجارب الزائدة المتشابهة التي يتنوع فيها تركيز المحفز المطلق. نظرًا لأن تركيز المحفز ثابت على مدار التفاعل ، فإن المؤامرات الناتجة يتم تطبيعها بقيمة غير متغيرة. إذا كانت المخططات الناتجة تتراكب تمامًا ، يكون التفاعل ، في الواقع ، من الدرجة الأولى في المحفز. إذا فشل التفاعل في التراكب ، فإن عمليات الترتيب الأعلى تعمل وتتطلب تحليلاً أكثر تفصيلاً مما هو موصوف هنا. [3] من الجدير بالذكر أيضًا أن معالجة التراكب الموصوف هنا ليست سوى طريقة واحدة لتفسير البيانات الأولية. يمكن الحصول على نتائج صحيحة على قدم المساواة من خلال ملاءمة السلوك الحركي الملحوظ لقوانين معدل المحاكاة.

استكشاف تنشيط المحفز وإلغاء تنشيطه تحرير

كما هو موضح أعلاه ، يتم إجراء نفس التجارب الزائدة مع تجربتين أو أكثر مع وجود فائض ، (ه) ثابتة أثناء تغيير التركيزات المطلقة للركائز (في هذه الحالة ، يُعامل المحفز أيضًا كركيزة.) لاحظ أن هذا البناء يتسبب في عدد المعادلات وبالتالي النسبة المئوية الخلدية لكل كاشف / محفز تختلف بين التفاعلات. [3] تمكن هذه التجارب المرء من "دخول" التفاعل بشكل مصطنع في أي نقطة ، حيث يتم اختيار التركيزات الأولية لتجربة واحدة (تفاعل الاعتراض) لرسم خريطة مباشرة على التركيزات المتوقعة في وقت وسيط ، ر، في آخر (رد فعل الوالدين). يمكن للمرء أن يتوقع تقدم التفاعل ، الموصوف بواسطة مخططات تركيز المعدل مقابل الركيزة المفصلة أعلاه ، لرسم خريطة مباشرة على بعضها البعض من نقطة الاعتراض تلك فصاعدًا. سيظل هذا صحيحًا ، مع ذلك ، فقط إذا لم يتم تغيير معدل التفاعل عن طريق التغييرات في الركيزة النشطة / تركيز المحفز (مثل تنشيط المحفز أو تعطيل المحفز أو تثبيط المنتج) قبل هذا الاعتراض. [2] [3]

يشير التراكب المثالي لتجارب متعددة مع نفس التحميل الزائد ولكن مختلف الركيزة الأولية إلى عدم حدوث تغييرات في الركيزة النشطة / تركيز المحفز خلال مسار التفاعل. يشير فشل القطع في التراكب بشكل عام إلى تنشيط المحفز أو إلغاء التنشيط أو تثبيط المنتج في ظل ظروف التفاعل. يمكن تمييز هذه الحالات من خلال موضع منحنيات تقدم التفاعل بالنسبة لبعضها البعض. اعتراض التفاعلات الكاذبة (معدلات أبطأ عند نفس تركيز الركيزة) التفاعلات الأصلية على معدل تركيز الركيزة مقابل مخطط تركيز الركيزة ، تدل على تنشيط المحفز تحت ظروف التفاعل. اعتراض التفاعلات الموجودة أعلاه (معدلات أسرع عند نفس تركيز الركيزة) التفاعلات الأصلية على المعدل مقابل مخطط تركيز الركيزة ، تدل على تعطيل المحفز تحت ظروف التفاعل مزيد من التجارب ضرورية لتمييز تثبيط المنتج عن الأشكال الأخرى لموت المحفز. [2]

يتمثل أحد الاختلافات الرئيسية بين تفاعل الاعتراض والتفاعل الرئيسي الموصوف أعلاه في وجود كمية من المنتج في التفاعل الأصلي عند نقطة الاعتراض. من المعروف منذ فترة طويلة أن تثبيط المنتج يؤثر على كفاءة المحفز للعديد من الأنظمة ، وفي حالة نفس التجارب الزائدة ، فإنه يمنع اعتراض ردود الفعل الأم من التراكب. في حين أن التجارب الزائدة نفسها كما هو موضح أعلاه لا يمكن أن تنسب إلغاء تنشيط المحفز إلى أي سبب معين ، يمكن التحقق من تثبيط المنتج من خلال مزيد من التجارب التي يتم فيها إضافة كمية أولية من المنتج إلى تفاعل الاعتراض (مصمم لتقليد كمية المنتج المتوقع وجوده في التفاعل الأم عند نفس تركيز الركيزة). يشير التراكب المثالي للمعدل مقابل مخططات تركيز الركيزة تحت نفس ظروف المنتج الزائد إلى أن تثبيط المنتج يحدث بالفعل في ظل ظروف التفاعل المستخدمة. في حين أن فشل المعدل مقابل مخططات تركيز الركيزة في التراكب في ظل نفس ظروف المنتج الزائدة لا يحول دون تثبيط المنتج ، فإنه يشير ، على الأقل ، إلى أن مسارات إلغاء تنشيط المحفز الأخرى يجب أن تكون نشطة أيضًا.

تعد التجارب الزائدة نفسها التي تبحث في تعطيل تنشيط المحفز وتثبيط المنتج من بين أكثر التطبيقات المستخدمة على نطاق واسع في التحليل الحركي لتقدم التفاعل. من بين الأمثلة العديدة في الأدبيات ، تتضمن بعض الدراسات التحري عن ألكلة الزنك الأمينية المحفزة بالكحول للألدهيدات ، [23] تحفيز الأميدو-ثيوريا تخليق Strecker غير المتماثل للأحماض الأمينية غير الطبيعية ، [5] وتنشيط SOMO للمحفزات العضوية. [14]

تحرير الطرق التفاضلية لاستخراج ثوابت المعدل

مع ثروة البيانات المتاحة من مراقبة تقدم التفاعل بمرور الوقت المقترنة بقوة طرق الحوسبة الحديثة ، أصبح من السهل بشكل معقول إجراء تقييم رقمي لقانون المعدل ، ورسم خرائط لقوانين المعدل المتكامل لمسارات التفاعلات المحاكاة على تناسب تقدم التفاعل بمرور الوقت . نظرًا لمبادئ انتشار الخطأ ، يمكن تحديد ثوابت المعدل وقوانين المعدل من خلال هذه الطرق التفاضلية مع عدم يقين أقل بكثير من بناء معادلات المعدل الرسومي (أعلاه). [9]

تحرير التجارب الزائدة المختلفة

بينما يسمح RPKA بمراقبة المعدلات على مدار التفاعل بأكمله ، فإن إجراء تجارب نفس الزائدة فقط لا يوفر معلومات كافية لتحديد ثوابت المعدل المقابلة. من أجل بناء علاقات مستقلة كافية لحل جميع ثوابت المعدل غير المعروفة ، من الضروري فحص الأنظمة ذات الفائض المختلف.

ضع في اعتبارك مرة أخرى المثال البسيط الذي تمت مناقشته أعلاه حيث يرتبط المحفز بالركيزة A ، متبوعًا بالتفاعل مع B لتكوين المنتج P والمحفز الحر. بغض النظر عن التقريب المطبق ، العديد من المعلمات المستقلة (ك2 و ك1 في حالة ما قبل التوازن ك1, ك−1، و ك2 في حالة الحالة المستقرة) لتحديد النظام. بينما يمكن للمرء أن يتخيل بناء معادلات متعددة لوصف المجهول بتركيزات مختلفة ، عندما يتم الحصول على البيانات من نفس التجربة الزائدة [أ] و [ب] لا تكون مستقلة:

تجارب متعددة باستخدام قيم مختلفة من ه ضرورية لإنشاء معادلات مستقلة متعددة تحدد ثوابت المعدل المستقل المتعددة من حيث المعدلات والتركيزات التجريبية. يمكن بعد ذلك استخدام تحليل المربعات الصغرى غير الخطية للحصول على أفضل قيم ملائمة لثوابت المعدل غير المعروفة لتلك المعادلات.

تعديل قوانين الرسوم البيانية

قياس التفاعل الكيميائي وآلية التحرير

من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من أن التحليل الحركي هو أداة قوية لتحديد القياس المتكافئ لحالة الانتقال المحددة للتسليم بالنسبة للحالة الأرضية ، فإنه لا يمكنه الإجابة على جميع الأسئلة الميكانيكية. من الممكن أن تكون آليتان غير قابلتين للتمييز الحركي ، خاصة في ظل الظروف التحفيزية. لأي تقييم ميكانيكي شامل ، من الضروري إجراء تحليل حركي لكل من العملية التحفيزية وخطواتها الفردية (عند الإمكان) بالتنسيق مع أشكال التحليل الأخرى مثل تقييم علاقات الطاقة الحرة الخطية ، ودراسات تأثير النظائر ، والتحليل الحسابي ، أو أي عدد من الأساليب البديلة. أخيرًا ، من المهم أن نلاحظ أنه لا يمكن إثبات أي فرضية ميكانيكية يمكن إثبات فرضية ميكانيكية بديلة فقط يمكن دحضها. لذلك ، من الضروري إجراء أي تحقيق بطريقة تعتمد على الفرضية. فقط من خلال دحض البدائل المعقولة تجريبيًا يمكن تعزيز دعم فرضية معينة. [25]


مراسلو لوسيفيراز

تم استخدام انبعاث الضوء لاكتشاف التغيرات التجريبية في المقايسات البيولوجية لما يقرب من 100 عام (1) ، وفي حين أن قائمة التطبيقات التي تستخدم الضوء المنبعث كإستراتيجية كشف طويلة ، فإن نوع الضوء المنبعث يختلف. اللمعان هو انبعاث ضوئي نتيجة تفاعل كيميائي دون إنتاج حرارة أو أي تغيرات حرارية. يختلف هذا النوع من الضوء بشكل واضح عن التوهج الذي يولد الحرارة وهو سبب تسخين المصابيح المتوهجة أثناء الاستخدام. يمكن فصل اللمعان إلى نوعين:

  • تلألؤ بيولوجي - الضوء المنبعث من مصدر بيولوجي
  • تلألؤ كيميائي - الضوء المنبعث من مصدر غير بيولوجي نتيجة تفاعل كيميائي

تطبيق ملاحظة- Luciferase Assay و Bio Tek Synergy Microplate Readers

تصف مذكرة التطبيق هذه التحقق من صحة ومقارنة الفحوصات الجينية لمراسل لوسيفيراز ذي الخطوة الواحدة والفلاش ثنائي الطيف باستخدام خط التآزر لقارئات الصفيحة الدقيقة.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

تلألؤ بيولوجي مقابل التألق

الإسفار هو نوع آخر من الضوء المنبعث يستخدم بشكل شائع في الأبحاث البيولوجية وهو نتاج فلوروفور ، وهو جزيء يمتص الطاقة من مصدر الضوء ثم ينبعث الضوء بطول موجة مختلف. Bioluminescence, on the other hand, differs from fluorescence in that the excitation energy is supplied by an enzymatic reaction rather than from a source of light. While both bioluminescence and fluorescence are widely used in scientific applications, bioluminescent reporters display an ultrasensitive detection capacity and have a wider dynamic range compared to fluorescent reporters because of the enzymatic nature of the bioluminescent reporter.

Bioluminescence vs. fluorescence. Bioluminescence (left) is emitted from the reaction of luciferase enzyme and its substrate, such as firefly luciferase and luciferin, respectively. Cofactor requirements (e.g., ATP, O2) vary depending on the luciferase used. Fluorescence (right) is the product of a fluorophore (e.g., FITC, Alexa Fluor dyes) absorbing the energy from a light source and emitting the light energy at a different wavelength.

Fluorescent reporters are susceptible to photo bleaching, provide low quantum yields and have greater protein stability in cell-based assays compared to bioluminescent reporters, which make them less amenable for use as real-time reporters. Cellular components also have auto fluorescent properties, which increases the non-specific background and decreases the sensitivity of fluorescent detection in cell-based assays. Conversely, cellular components have no inherent bioluminescence, allowing for greater sensitivity with bioluminescent assays.

However, fluorescent reporters are more useful for visualizing targets in live cells than bioluminescent proteins, because fluorophores do not require cofactors or exogenous substrates for activity and are more stable than bioluminescent reporters.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

Bioluminescence in nature

Uses of bioluminescence in nature are quite diverse and are exhibited by both unicellular organisms like bacteria and dinoflagellates and higher-order organisms such as fish and insects. Bioluminescence is used by both terrestrial and aquatic organisms, although it is more commonly seen in marine animals, especially those living in the extreme depths of the ocean. Bioluminescence serves many natural purposes for these organisms.

Defense: A strong bioluminescent signal can be used by prey to temporally blind an attacking predator, giving the prey a chance to escape. The light produced by the prey also puts the potential predator at the risk of being detected by other predators.

Camouflage: Animals that normally dwell in oceanic dark zones, including firefly squids, krill, dogfish sharks and hatchet- and lantern fish, come to the surface to feed at night. These animals use counter-illumination to blend into surrounding areas illuminated by moonlight. Similar camouflage is also used by certain species of shallow-water squid that give off light to blend in with the moonlight.

Feeding: Predators often use bioluminescence to attract prey. The anglerfish, for example, lures prey using an elongated dorsal spine that supports a light-producing organ that houses bioluminescent bacteria. Also, some octopi, including Stauroteuthis syrtensis, have suckers that are lined with organs that produce blue-green light that are also used to attract prey.

Mating: Terrestrial animals such as fireflies, glow worms and marine animals like the octopod Japetella diaphana use bioluminescence to attract a mate.

Bioluminescent reaction

Two agents are essential for a bioluminescent reaction to occur: luciferase, the enzyme that catalyzes the reaction, and the luciferase substrate. A wide variety of luciferase enzymes have been discovered, although the general mechanism of the light-producing reaction for all of the enzymes is the oxidative decarboxylation of the luciferase substrate in the presence of O2 to yield photon emission (light).

Luciferases likely evolved at multiple stages during the course of history to yield enzymes that differ in expression pattern, substrate specificity, cofactor requirement and enzyme kinetics. The result of these evolutionary changes is that some organisms, such as bacteria and fungi, can emit light continuously, while other organisms emit bioluminescent flashes with varying duration and intensity. For example, the luminescence from a dinoflagellete is short, lasting 0.1 seconds, while that from jellyfish can last tens of seconds.

The variation in bioluminescent output by different luciferase enzymes has allowed scientists to classify them based on their output kinetics to accommodate different experimental designs. Luciferase enzymes with flash kinetics have maximum sensitivity because of high signal intensity, although the emitted light also rapidly decays. Conversely, enzymes with glow kinetics are less sensitive but stably emit light for at least 60 minutes.


Luciferase flash vs. glow kinetics. Schematic representation of the bioluminescent output of luciferase enzymes with flash and glow kinetics as a function of time. RLU: relative light units.


REVERSIBLE FIRST-ORDER REACTIONS

Changes in conformation (i.e., isomerization) are another common type of first-order reaction. For example, if molecule A exists in two conformations, A and A*. The reaction is

The rates of the forward and reverse first-order reactions are

المعلمات ك+ و ك are the first-order rate constants for the forward and reverse reactions, with units of s −1 , and [A] and [A*] are the concentrations of A and A* at a given moment in time. As with dissociation (Eq. 2), these first-order rate constants are the probabilities of the events per unit time and do not depend on the concentration of A or A*. However, the overall rates of such reactions in bulk samples depend on the rate constant and concentration as defined in Eq. 6.

Relation of rate constants to equilibrium constants for reversible first-order reactions

An equilibrium constant characterizes the balance between the two conformations. At equilibrium, the forward and reverse rates of this pair of first-order reactions are equal, so and the association equilibrium constant is

Note that, in contrast to the binding reaction, the equilibrium constant for a pair of reversible first-order reactions is unitless. This difference might be troubling, but actually الكل equilibrium constants are unitless—even those for bimolecular reactions! This is because the equations for equilibrium constants actually call for “chemical activities” rather than the concentrations that everyone uses in their experiments. Recall from your general chemistry class that the chemical activity of a molecule is given by a comparison with a standard-state condition. This comparison is made by dividing the actual concentration by the standard-state concentration. In biochemistry, the standard condition is 1 M, so activities are defined as ratios of concentrations in M relative to 1 M. As a result, chemical activities are unitless but have the same numerical values as the molar concentrations.

This is a good place to note that chemical activities also depend on the environment because of the effects that solution conditions can have on the activity coefficient of molecules. The activity coefficient is a scaling factor that accounts for interactions among molecules (i.e., nonideality) that influence their ability to react. In dilute solution, the activity coefficient is unity, so the chemical activities of molecules are the same as the molar concentrations. However, in crowded environments, such as cytoplasm, activities may be much higher than the molar concentrations (Zhou وآخرون، 2008). Hence many bimolecular reactions and some first-order reactions are faster in cytoplasm than in dilute buffers.


Concentration of Substrate

In the presence of a given amount of enzyme, the rate of an enzymatic reaction increases as the substrate concentration increases until a limiting rate is reached, after which further increase in the substrate concentration produces no significant change in the reaction rate (part (a) of Figure 18.13 "Concentration versus Reaction Rate"). At this point, so much substrate is present that essentially all of the enzyme active sites have substrate bound to them. In other words, the enzyme molecules are saturated with substrate. The excess substrate molecules cannot react until the substrate already bound to the enzymes has reacted and been released (or been released without reacting).

Figure 18.13 Concentration versus Reaction Rate

(a) This graph shows the effect of substrate concentration on the rate of a reaction that is catalyzed by a fixed amount of enzyme. (b) This graph shows the effect of enzyme concentration on the reaction rate at a constant level of substrate.

Let’s consider an analogy. Ten taxis (enzyme molecules) are waiting at a taxi stand to take people (substrate) on a 10-minute trip to a concert hall, one passenger at a time. If only 5 people are present at the stand, the rate of their arrival at the concert hall is 5 people in 10 minutes. If the number of people at the stand is increased to 10, the rate increases to 10 arrivals in 10 minutes. With 20 people at the stand, the rate would still be 10 arrivals in 10 minutes. The taxis have been “saturated.” If the taxis could carry 2 or 3 passengers each, the same principle would apply. The rate would simply be higher (20 or 30 people in 10 minutes) before it leveled off.


Luciferase Reporters

Light emission has been used to detect experimental changes in biological assays for almost 100 years (1), and while the list of applications that use emitted light as a detection strategy is long, the type of light emitted varies. Luminescence is light emission as a result of a chemical reaction without the production of heat or any thermal changes. This type of light is clearly different from incandescence, which generates heat and is the reason why incandescent light bulbs get hot during use. Luminescence can be separated into two types:

  • تلألؤ بيولوجي – light emitted from a biological source
  • Chemiluminescence – light emitted from a non-biological source due to a chemical reaction

Application Note-Luciferase Assay and Bio Tek Synergy Microplate Readers

This application note describes validation and comparison of single-step flash and dual-spectral luciferase reporter gene assays using the Synergy line of microplate readers.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

Bioluminescence vs. fluorescence

Fluorescence is another type of emitted light commonly used in biological research and is the product of a fluorophore, a molecule that absorbs the energy from a light source and then emits light at a different wavelength. Bioluminescence, on the other hand, differs from fluorescence in that the excitation energy is supplied by an enzymatic reaction rather than from a source of light. While both bioluminescence and fluorescence are widely used in scientific applications, bioluminescent reporters display an ultrasensitive detection capacity and have a wider dynamic range compared to fluorescent reporters because of the enzymatic nature of the bioluminescent reporter.

Bioluminescence vs. fluorescence. Bioluminescence (left) is emitted from the reaction of luciferase enzyme and its substrate, such as firefly luciferase and luciferin, respectively. Cofactor requirements (e.g., ATP, O2) vary depending on the luciferase used. Fluorescence (right) is the product of a fluorophore (e.g., FITC, Alexa Fluor dyes) absorbing the energy from a light source and emitting the light energy at a different wavelength.

Fluorescent reporters are susceptible to photo bleaching, provide low quantum yields and have greater protein stability in cell-based assays compared to bioluminescent reporters, which make them less amenable for use as real-time reporters. Cellular components also have auto fluorescent properties, which increases the non-specific background and decreases the sensitivity of fluorescent detection in cell-based assays. Conversely, cellular components have no inherent bioluminescence, allowing for greater sensitivity with bioluminescent assays.

However, fluorescent reporters are more useful for visualizing targets in live cells than bioluminescent proteins, because fluorophores do not require cofactors or exogenous substrates for activity and are more stable than bioluminescent reporters.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

Bioluminescence in nature

Uses of bioluminescence in nature are quite diverse and are exhibited by both unicellular organisms like bacteria and dinoflagellates and higher-order organisms such as fish and insects. Bioluminescence is used by both terrestrial and aquatic organisms, although it is more commonly seen in marine animals, especially those living in the extreme depths of the ocean. Bioluminescence serves many natural purposes for these organisms.

Defense: A strong bioluminescent signal can be used by prey to temporally blind an attacking predator, giving the prey a chance to escape. The light produced by the prey also puts the potential predator at the risk of being detected by other predators.

Camouflage: Animals that normally dwell in oceanic dark zones, including firefly squids, krill, dogfish sharks and hatchet- and lantern fish, come to the surface to feed at night. These animals use counter-illumination to blend into surrounding areas illuminated by moonlight. Similar camouflage is also used by certain species of shallow-water squid that give off light to blend in with the moonlight.

Feeding: Predators often use bioluminescence to attract prey. The anglerfish, for example, lures prey using an elongated dorsal spine that supports a light-producing organ that houses bioluminescent bacteria. Also, some octopi, including Stauroteuthis syrtensis, have suckers that are lined with organs that produce blue-green light that are also used to attract prey.

Mating: Terrestrial animals such as fireflies, glow worms and marine animals like the octopod Japetella diaphana use bioluminescence to attract a mate.

Bioluminescent reaction

Two agents are essential for a bioluminescent reaction to occur: luciferase, the enzyme that catalyzes the reaction, and the luciferase substrate. A wide variety of luciferase enzymes have been discovered, although the general mechanism of the light-producing reaction for all of the enzymes is the oxidative decarboxylation of the luciferase substrate in the presence of O2 to yield photon emission (light).

Luciferases likely evolved at multiple stages during the course of history to yield enzymes that differ in expression pattern, substrate specificity, cofactor requirement and enzyme kinetics. The result of these evolutionary changes is that some organisms, such as bacteria and fungi, can emit light continuously, while other organisms emit bioluminescent flashes with varying duration and intensity. For example, the luminescence from a dinoflagellete is short, lasting 0.1 seconds, while that from jellyfish can last tens of seconds.

The variation in bioluminescent output by different luciferase enzymes has allowed scientists to classify them based on their output kinetics to accommodate different experimental designs. Luciferase enzymes with flash kinetics have maximum sensitivity because of high signal intensity, although the emitted light also rapidly decays. Conversely, enzymes with glow kinetics are less sensitive but stably emit light for at least 60 minutes.


Luciferase flash vs. glow kinetics. Schematic representation of the bioluminescent output of luciferase enzymes with flash and glow kinetics as a function of time. RLU: relative light units.


2 Michaelis–Menten progress curve Kinetics

It is quite satisfying to note that modern computational methods of data fitting produce essentially the same value for الخامس الأعلى/كم as that derived by Michaelis and Menten with pen and paper 100 years ago. Michaelis and Menten presented an average value of الخامس الأعلى/كم = 0.045 ± 0.003 m −1 , whereas our global analysis of their data gives a value of 0.046 ± 0.001 m −1 . Fig. 2 A shows the original Michaelis–Menten full progress curve data fit by nonlinear regression analysis based upon numerical integration of rate equations for the complete model (Scheme 1 ) along with confidence contour analysis using KinTek Explorer software [11, 12] . An example file (Michaelis–Menten_1913.mec) showing these data is available with the free student version of KinTek Explorer available for both Mac and Windows PCs at http://www.kintek-corp.com.

During the past century, fitting full time course kinetic data has not gained the wide acceptance of initial velocity measurements, in part, because there is no universal equation describing the approach to equilibrium. Derivations usually rely upon the approximation that the substrate remains in excess over enzyme even as the reaction approaches equilibrium, a requirement that may not always be met. New approaches to deriving an analytical expression for full time course kinetics have been presented [13] , but even these require complex mathematical functions. Recently there has been increased interest in fitting full time course kinetic data brought on by the ease of fitting based upon numerical integration of rate equations without simplifying approximations [12, 14, 15] . Indeed, as shown in Fig. 2A, global fitting of the original Michaelis–Menten data easily reproduces in seconds what must have taken months of computation by hand. It is a tribute to their skill and diligence that modern computer based analysis provides essentially the same value for their constant as Michaelis and Menten calculated a century ago.


Luciferase Reporters

Light emission has been used to detect experimental changes in biological assays for almost 100 years (1), and while the list of applications that use emitted light as a detection strategy is long, the type of light emitted varies. Luminescence is light emission as a result of a chemical reaction without the production of heat or any thermal changes. This type of light is clearly different from incandescence, which generates heat and is the reason why incandescent light bulbs get hot during use. Luminescence can be separated into two types:

  • تلألؤ بيولوجي – light emitted from a biological source
  • Chemiluminescence – light emitted from a non-biological source due to a chemical reaction

Application Note-Luciferase Assay and Bio Tek Synergy Microplate Readers

This application note describes validation and comparison of single-step flash and dual-spectral luciferase reporter gene assays using the Synergy line of microplate readers.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

Bioluminescence vs. fluorescence

Fluorescence is another type of emitted light commonly used in biological research and is the product of a fluorophore, a molecule that absorbs the energy from a light source and then emits light at a different wavelength. Bioluminescence, on the other hand, differs from fluorescence in that the excitation energy is supplied by an enzymatic reaction rather than from a source of light. While both bioluminescence and fluorescence are widely used in scientific applications, bioluminescent reporters display an ultrasensitive detection capacity and have a wider dynamic range compared to fluorescent reporters because of the enzymatic nature of the bioluminescent reporter.

Bioluminescence vs. fluorescence. Bioluminescence (left) is emitted from the reaction of luciferase enzyme and its substrate, such as firefly luciferase and luciferin, respectively. Cofactor requirements (e.g., ATP, O2) vary depending on the luciferase used. Fluorescence (right) is the product of a fluorophore (e.g., FITC, Alexa Fluor dyes) absorbing the energy from a light source and emitting the light energy at a different wavelength.

Fluorescent reporters are susceptible to photo bleaching, provide low quantum yields and have greater protein stability in cell-based assays compared to bioluminescent reporters, which make them less amenable for use as real-time reporters. Cellular components also have auto fluorescent properties, which increases the non-specific background and decreases the sensitivity of fluorescent detection in cell-based assays. Conversely, cellular components have no inherent bioluminescence, allowing for greater sensitivity with bioluminescent assays.

However, fluorescent reporters are more useful for visualizing targets in live cells than bioluminescent proteins, because fluorophores do not require cofactors or exogenous substrates for activity and are more stable than bioluminescent reporters.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

Bioluminescence in nature

Uses of bioluminescence in nature are quite diverse and are exhibited by both unicellular organisms like bacteria and dinoflagellates and higher-order organisms such as fish and insects. Bioluminescence is used by both terrestrial and aquatic organisms, although it is more commonly seen in marine animals, especially those living in the extreme depths of the ocean. Bioluminescence serves many natural purposes for these organisms.

Defense: A strong bioluminescent signal can be used by prey to temporally blind an attacking predator, giving the prey a chance to escape. The light produced by the prey also puts the potential predator at the risk of being detected by other predators.

Camouflage: Animals that normally dwell in oceanic dark zones, including firefly squids, krill, dogfish sharks and hatchet- and lantern fish, come to the surface to feed at night. These animals use counter-illumination to blend into surrounding areas illuminated by moonlight. Similar camouflage is also used by certain species of shallow-water squid that give off light to blend in with the moonlight.

Feeding: Predators often use bioluminescence to attract prey. The anglerfish, for example, lures prey using an elongated dorsal spine that supports a light-producing organ that houses bioluminescent bacteria. Also, some octopi, including Stauroteuthis syrtensis, have suckers that are lined with organs that produce blue-green light that are also used to attract prey.

Mating: Terrestrial animals such as fireflies, glow worms and marine animals like the octopod Japetella diaphana use bioluminescence to attract a mate.

Bioluminescent reaction

Two agents are essential for a bioluminescent reaction to occur: luciferase, the enzyme that catalyzes the reaction, and the luciferase substrate. A wide variety of luciferase enzymes have been discovered, although the general mechanism of the light-producing reaction for all of the enzymes is the oxidative decarboxylation of the luciferase substrate in the presence of O2 to yield photon emission (light).

Luciferases likely evolved at multiple stages during the course of history to yield enzymes that differ in expression pattern, substrate specificity, cofactor requirement and enzyme kinetics. The result of these evolutionary changes is that some organisms, such as bacteria and fungi, can emit light continuously, while other organisms emit bioluminescent flashes with varying duration and intensity. For example, the luminescence from a dinoflagellete is short, lasting 0.1 seconds, while that from jellyfish can last tens of seconds.

The variation in bioluminescent output by different luciferase enzymes has allowed scientists to classify them based on their output kinetics to accommodate different experimental designs. Luciferase enzymes with flash kinetics have maximum sensitivity because of high signal intensity, although the emitted light also rapidly decays. Conversely, enzymes with glow kinetics are less sensitive but stably emit light for at least 60 minutes.


Luciferase flash vs. glow kinetics. Schematic representation of the bioluminescent output of luciferase enzymes with flash and glow kinetics as a function of time. RLU: relative light units.


FAST EVENTS IN PROTEIN FOLDING: The Time Evolution of Primary Processes

الملخصMost experimental studies on the dynamics of protein folding have been confined to timescales of 1 ms and longer. Yet it is obvious that many phenomena that are obligatory elements of the folding process occur on much faster timescales. For example, it is also now clear that the formation of secondary and tertiary structures can occur on nanosecond and microsecond times, respectively. Although fast events are essential to, and sometimes dominate, the overall folding process, with a few exceptions their experimental study has become possible only recently with the development of appropriate techniques. This review discusses new approaches that are capable of initiating and monitoring the fast events in protein folding with temporal resolution down to picoseconds. The first important results from those techniques, which have been obtained for the folding of some globular proteins and polypeptide models, are also discussed.


شاهد الفيديو: What are Enzymes - How Do They Work? (ديسمبر 2022).