معلومة

في SDS-PAGE ، لماذا يختلف المخزن المؤقت للعينة وتشغيل المخزن المؤقت في التركيز؟

في SDS-PAGE ، لماذا يختلف المخزن المؤقت للعينة وتشغيل المخزن المؤقت في التركيز؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول حاليًا فهم مفاهيم SDS-PAGE. يشير كل بروتوكول قرأته إلى استخدام 5X لعينة المخزن المؤقت و 1 X لتشغيل المخزن المؤقت ، لكنني لا أفهم حقًا لأي سبب؟ ما هي العواقب السلبية إذا لم أفعل؟


السبب وراء تركيز المخزن المؤقت للعينة (عادةً 2x أو 5x اعتمادًا على تركيز البروتين الخاص بك) هو تخفيفه عند مزجه مع العينة. يمكنك خلط 4 أجزاء من العينة وجزء واحد من المخزن المؤقت للعينة 5x ، بحيث يكون التركيز النهائي لهذا المخزن المؤقت 1x.

إذا كنت تستخدم مخزنًا مؤقتًا للعينة 1x مع نفس الكمية من العينة ، فسيكون التركيز النهائي للمخزن المؤقت للعينة 0.5x ، وإذا فعلت نفس 4 + 1 ، فسيكون 0.2x فقط في النهاية.

هذا التخفيف قوي للغاية ولن يفي المخزن المؤقت بالغرض منه ، وهو التمسخ الكامل لجميع البروتينات في العينة ، بحيث يعتمد توزيعها على الهلام فقط على وزنها الجزيئي وليس أيضًا على هيكلها الثلاثي / الرباعي.

يتيح لك استخدام المخزن المؤقت 5x إضافة الكثير من العينات عند تخفيفها إلى 1x دون تغيير تركيز البروتين كثيرًا. كما يسمح بتحميل كميات أكبر من العينة مقارنة بالمخزن المؤقت 2x ، وهو أمر مثير للاهتمام عندما يكون تركيز البروتين منخفضًا.

لا يتم تخفيف المخزن المؤقت للتشغيل عن طريق إضافة عينة ، بحيث يجب تخفيفه إلى 1x للحصول على القوة الأيونية الصحيحة. نظرًا لأن هذه غالبًا ما تستخدم بكميات كبيرة في المختبر ، فمن الملائم إعداد مخازن مركزة بكميات أقل وتخفيفها قبل الاستخدام بدلاً من تحضير خزانات كبيرة من المخزن المؤقت.


لماذا الغول .. عينات لـ sdspage - عينة + عينة المخزن المؤقت + & # 39BOIL & # 39 2 دقيقة (يوليو / 31/2009)

تتضمن البروتوكولات القياسية لـ sdspage إضافة عينة عازلة إلى عينة البروتين ثم غليان العينات لمدة دقيقتين .. قبل التحميل على الجل.
هل هناك سبب محدد لغلي العينات.
هل هذا خاص لتقليل العينات؟ أو ينطبق على كل من الظروف غير المختزلة والظروف المختزلة.

لماذا وإلى متى يجب غليان العينات. ما الذي يقرر الوقت؟

(حاول ألا تغلي - أنت & # 39 ليرة لبنانية ترى ما أعنيه)

تعمل درجة الحرارة المرتفعة على تغيير طبيعة البروتين وتعزز التمسخ بواسطة SDS ، كما أنها تكسر روابط ثنائي الكبريتيد وتعزز (تسرع) التفاعل مع تقليل الخسارة (مثل DTT و bME).

ك. في Jul 31 2009، 07 & # 5853 AM قال:

حاولت عدم الغليان لأوقات مختلفة .. دقيقتان و 5 دقائق ن وهكذا ..
عندما لا أغلي عيناتي لا أرى رباطًا بوزن جزيئي منخفض .. وعندما أغلي .. يزداد مع زيادة وقت الغليان.

أيضا ، زيادة كمية sds في المخزن المؤقت للعينة .. أقل كثافة الفرقة ذات الوزن الجزيئي المنخفض ..

أيه أفكار.. ؟
كيف لي أن أعرف ما إذا كانت هذه الفرقة موجودة بالفعل أم لا؟

قد يؤدي الغليان لفترة طويلة إلى تدهور البروتين. هذا قد يفسر الفرقة.

أما بالنسبة لـ sds .. فأنا لا أعرف & # 33

alicee & # 33 في 2 أغسطس 2009 ، 10 & # 5851 مساءً قال:

ك. في Jul 31 2009، 07 & # 5853 AM قال:

حاولت عدم الغليان لأوقات مختلفة .. دقيقتان و 5 دقائق ن وهكذا ..
عندما لا أغلي عيناتي لا أرى رباطًا بوزن جزيئي منخفض .. وعندما أغلي .. يزداد مع زيادة وقت الغليان.

أيضا ، زيادة كمية sds في المخزن المؤقت للعينة .. أقل كثافة الفرقة ذات الوزن الجزيئي المنخفض ..

أيه أفكار.. ؟
كيف لي أن أعرف ما إذا كانت هذه الفرقة موجودة بالفعل أم لا؟

1. هذه مسألة تحسين (على سبيل المثال ، يمكنك تجربة العديد من الشروط - عدم الغليان ، بعض الغليان ، المزيد من الغليان ، أقل SDS ، المزيد من SDS ، إلخ). بعض البروتينات ، اعتمادًا على خصائصها الفيزيائية ومكياجها الكيميائي ، تعمل بشكل أفضل مع الغليان ، وبعضها لا يعمل (خاصة بروتينات الغشاء).

2. كقاعدة عامة (لا تنطبق دائمًا) ، كلما زاد MW ، كلما زاد وقت الغليان ، يتطلب الأمر المزيد من تركيز SDS.

1. إذا كان منتجًا معينًا وشريطًا محددًا يأتي مع الجسم المضاد المحدد فقط وليس مع IgG ،

2. إذا كان هو الحجم المتوقع ،

3. إذا اختفت من خلال تجارب المنافسة المحكومة جيدًا ،

4. وأخيرًا ، إذا لم يكن هناك شيء مؤكد ، إذا قمت بتسلسل البروتين ،

قال cellcounter في 4 أغسطس 2009 ، 07 & # 5818 صباحًا:

alicee & # 33 في 2 أغسطس 2009 ، 10 & # 5851 مساءً قال:

ك. في Jul 31 2009، 07 & # 5853 AM قال:

حاولت عدم الغليان لأوقات مختلفة .. دقيقتان و 5 دقائق ن وهكذا ..
عندما لا أغلي عيناتي لا أرى رباطًا بوزن جزيئي منخفض .. وعندما أغلي .. يزداد مع زيادة وقت الغليان.

أيضا ، زيادة كمية sds في المخزن المؤقت للعينة .. أقل كثافة الفرقة ذات الوزن الجزيئي المنخفض ..

أيه أفكار.. ؟
كيف لي أن أعرف ما إذا كانت هذه الفرقة موجودة بالفعل أم لا؟

1. هذه مسألة تحسين (على سبيل المثال ، يمكنك تجربة العديد من الشروط - عدم الغليان ، بعض الغليان ، المزيد من الغليان ، أقل SDS ، المزيد من SDS ، إلخ). بعض البروتينات ، اعتمادًا على خصائصها الفيزيائية ومكياجها الكيميائي ، تعمل بشكل أفضل مع الغليان ، وبعضها لا يعمل (خاصة بروتينات الغشاء).
نعم ولكن هناك ظروف مختلفة تظهر نتائج مختلفة .. من الصعب تحديد أي من هذه النتائج هو الصحيح.
المعنى .. ممنوع الغليان .. مقابل الغليان لمدة دقيقتين. 5 دقائق .. ن حتى 10 دقائق .. يزيد الشريط الجزيئي السفلي في شدته. من الصعب تحديد ما إذا كان هذا موجودًا بالفعل في العينة (بعض مدى ارتباطه / ارتباطه بالبروتين الرئيسي) ويتم فصله في وجود محلول العينة ومعالجة الغليان.
نفس الشيء مع sds .. أعلى نسبة sds إلى البروتين .. خفض شدة النطاق المنخفضة ميغاواط. من الصعب تحديد النتيجة الحقيقية.
فلا يجوز التبليغ عن النجاسة إذا كانت موجودة. كما يجب معرفة مقدار النجاسة الحقيقي ، لكن المشاكل الإجرائية لا تجيب على هذه الأسئلة.

2. كقاعدة عامة (لا تنطبق دائمًا) ، كلما زاد MW ، كلما زاد وقت الغليان ، يتطلب الأمر المزيد من تركيز SDS.
منجم قريب من 19 كيلو دالتون. أرى نطاقًا إضافيًا بالقرب من 14-15 كيلو دالتون.

1. إذا كان منتجًا معينًا وشريطًا محددًا يأتي مع الجسم المضاد المحدد فقط وليس مع IgG ،
نعم ، إنه منتج محدد ، مؤكد من خلال الكشف المناعي على لطخة غربية.

2. إذا كان هو الحجم المتوقع ،

3. إذا اختفت من خلال تجارب المنافسة المحكومة جيدًا ،

4. وأخيرًا ، إذا لم يكن هناك شيء مؤكد ، إذا قمت بتسلسل البروتين ،

حجم البروتين: 19 كيلو دالتون
تم الحصول على نطاق منخفض ميغاواط: 14 كيلو دالتون.
في الغالب مع تسلسل طرفي سليم N. قد يتم اقتطاعها عند محطة C. أنا غير قادر على تسلسل هذا.
غير قادر على الإجابة عما إذا كان هذا النطاق صحيحًا أو تم إنشاؤه بسبب عينة من العلاج.
إذا كنت أعرف موقع الانقسام ، فكيف يساعد ذلك في تأكيد مقدار وجوده.

أي عينة بروتين في حالة تقليل SDS PAGE ، يجب غلي العينة مع SSB لمدة 5 دقائق على الأقل ، سيعزز الغليان عمل SDS ، وبالتالي يصبح الهيكل الثلاثي للبروتينات أساسيًا وسيؤدي إلى كسر رابطة ثاني كبريتيد عن طريق تقليل العامل في SSB تشكيل فرقة واحدة للفصل على أساس الشحنة والوزن الجزيئي في هلام.

ماذا عن التدوير لأسفل بعد الغليان ، ما المدة التي تستغرقها في الدوران وبأي درجة حرارة وعدد الدورات في الدقيقة؟ هل فوائد الدوران أطول؟

قال بيل ناي في 1 سبتمبر 2009 ، 04 & # 5819 مساءً:

فقط لتدوير أي جزء لكل تريليون تتشكل أثناء تحضير العينة. عادةً ما أقوم بالدوران بأقصى سرعة (13000 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق وأقوم بتحميل المادة الطافية.


بولي أكريلاميد جل الكهربائي

بولي أكريلاميد من المحتمل أن يكون الفصل الكهربائي للهلام (PAGE) هو التقنية التحليلية الأكثر شيوعًا المستخدمة لفصل البروتينات وتوصيفها. حل الأكريلاميد و bisacrylamide بلمرة. تشكل مادة الأكريلاميد وحدها بوليمرات خطية. يقدم بيساكرلميد روابط متقاطعة بين سلاسل بولي أكريلاميد. يتم تحديد "حجم المسام" من خلال نسبة مادة الأكريلاميد إلى بيساكريلاميد ، وبتركيز مادة الأكريلاميد. يؤدي وجود نسبة عالية من بيساكريلاميد إلى مادة الأكريلاميد وارتفاع تركيز مادة الأكريلاميد إلى انخفاض الحركة الكهربية. بلمرة الأكريلاميد وبيساكرلميد مونومرات يتم إحداثه بواسطة بيرسلفات الأمونيوم (APS) ، والذي يتحلل تلقائيًا لتشكيل الجذور الحرة. يتم تضمين TEMED ، وهو مثبت الجذور الحرة ، بشكل عام لتعزيز البلمرة.

عادة ما يتم تحضير المواد الهلامية مع الجزء العلوي من الهلام الموجود أسفل آبار العينة التي تكون أقل كثافة من باقي الجل الذي يتم جعله أكثر كثافة عن قصد. يشار إلى الجزء العلوي باسم & ldquostacking gel & rdquo والجزء السفلي يسمى & ldquorunning gel & rdquo أو & ldquoseparating gel & rdquo. الغرض من جل التكديس هو تركيز جميع البروتينات ذات الأحجام المختلفة في منطقة أفقية مضغوطة عن طريق حشرها بين تدرج جزيئات الجلايسين أعلاه وأيونات الكلوريد أدناه. بهذه الطريقة ، ستدخل معظم البروتينات في الهلام الأكثر كثافة في آنٍ واحد قبل أن تبدأ في الانتقال إلى الأسفل بمعدلات مختلفة بناءً على حجمها. بهذه الطريقة ، تكون النطاقات أكثر وضوحًا وأفضل فصلًا عن التصور والتحليل. بدون هلام التكديس ، ستنتج البروتينات مسحة طويلة من خلال الجل المحلول بدلاً من الأشرطة المتميزة المشدودة حتى نتمكن من تحليلها.

الشكل 1. هلام PAGE. يمر البروتين أولاً عبر هلام التراص ، حيث تنتشر العينات. بمجرد وصول البروتين إلى الجل الفاصل ، تتجمع البروتينات معًا في أشرطة ضيقة. أثناء تحركهم خلال هلام الحل ينفصلون حسب الحجم.

SDS-PAGE

كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) عبارة عن برمائي منظف. لديها مجموعة رأس أنيونية و محبة للدهون ذيل. يرتبط بشكل غير تساهمي بالبروتينات ، حيث ينجذب جزيء SDS واحد تقريبًا إلى كل نوعين من الأحماض الأمينية. يتسبب SDS في تفسد البروتينات وفصلها عن بعضها البعض (باستثناء الارتباط التساهمي المتقاطع) وتنحل بشكل أساسي إلى جزيئات خطية. كما أنه يمنح شحنة سالبة. في وجود SDS ، يتم إخفاء الشحنة الذاتية للبروتين. أثناء SDS-PAGE ، تهاجر جميع البروتينات نحو القطب الموجب (القطب الموجب الشحنة). البروتينات المعالجة بـ SDS لها نسب شحنة إلى كتلة متشابهة جدًا ، وأشكال مماثلة. خلال PAGE ، يتم تحديد معدل هجرة البروتينات المعالجة بـ SDS بشكل فعال من خلال طولها غير المطوي ، والذي يرتبط بوزنها الجزيئي.

الشكل 2: بروتين محاط بجزيئات SDS.


كميات للتحميل

بولي أكريلاميد له قدرة محدودة على البروتين. ينتج عن التحميل الزائد هطول الأمطار وتجميع البروتينات ، مما ينتج عنه خطوط ومسحات. ينتج عن التحميل الزائد خيبة أمل كاملة ، حيث قد يكتشف المرء فقط أكثر الببتيدات وفرة ، إذا كان ذلك. تتمثل أهداف تحضير العينة في وضع البروتينات في مخزن مؤقت لتغيير طبيعة البروتينات ، مما يجعلها مناسبة للرحلان الكهربي ، وضبط تركيزات العينة بحيث يمكن تحميل كمية مناسبة من البروتين على مادة هلامية.

نحصل على أفضل النتائج إذا قمنا بتحميل 10 ميكرول من تركيز نهائي 2 مجم / مل من البروتين المشوه لكل عينة جيدًا. في حين أن بعض البروتينات الأكثر تركيزًا سيتم تحميلها بشكل زائد ، فسوف نكتشف العصابات التي تمثل الأقل شيوعًا. بئر جل صغير نموذجي يحمل 10 ميكرول بسهولة ، وربما 20 ميكرول أو أكثر إذا كانت فواصل الآبار في حالة جيدة.

سنخفف جميع العينات إلى تركيز وحجم محددين مسبقًا قبل الخلط مع المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة. يقسم موظفو المختبر الفعالون المسؤوليات ، بحيث أثناء بلمرة المواد الهلامية ، فإنهم يعدون العينات بأنفسهم ، إلى أحجام تصل على الأقل إلى ضعف الحد الأدنى المطلوب لملء آبار العينة. يبدأ هؤلاء الأشخاص عملهم معدة بحسابات لأحجام العينة ، والماء ، و 2x عينة مركزة من المخزن المؤقت الذي يحتاجون إليه من أجل تحضير كل عينة من عيناتهم للرحلان الكهربي.

لإفساد العينات تمامًا ، نقوم بتسخينها في حمام مائي بخار لمدة 10 دقائق على الأقل. يتم إعداد معايير تحديد الوزن الجزيئي بنفس الطريقة. إنها باهظة الثمن ، وعلى الرغم من أن الموردين يقدمون تعليمات للخلط ، فمن الضروري عادةً اختبارها وإجراء تعديلات قبل الاعتماد عليها للمعايرة الداخلية لمادة هلامية مهمة. يجب طرد العينة & quotdirty & quot (التي تحتوي على الكثير من الجسيمات) قبل التحميل مباشرة. ومع ذلك ، فإن العينات التي تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان فقط وعينات من تجزئة الدم النموذجية هي & quot؛ كلين & quot؛ أن الطرد المركزي ليس ضروريًا.


  • 62.5 مم Tris-HCl الأس الهيدروجيني 6.8
  • 2.5 & # 160٪ SDS
  • 0.002 & # 160٪ أزرق بروموفينول
  • 0.7135 م (5٪) β-مركابتوإيثانول
  • 10 & # 160٪ جلسرين

لعمل 10 مل من مخزون 10x

  • في 70 & # 160٪ جلسرين / 30 & # 160٪ ماء ، قم بإذابة ما يلي:
    • 0.606 جم تريس-بيس
    • 2.5 جرام SDS
    • اضبط الأس الهيدروجيني باستخدام شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني إلى 6.8
    • أضف 2 مجم من Bromophenol Blue وتأكد من ذوبان المسحوق تمامًا
    • ضبط الحجم النهائي إلى 10 مل مع 70 & # 160٪ جلسرين / 30 & # 160٪ ماء قبل التخزين في -20 درجة مئوية.
    • أضف الحجم المناسب من مخزون β-mercaptoethanol 100٪ إلى عيناتك قبل تغيير طبيعتها عند 95 درجة مئوية.

    كل شيء عن الجلايسين

    إذن ما الأمر مع الجلايسين؟
    كثيرا. إنه مفتاح نظام المخزن المؤقت غير المستمر. إنها الحالة الأيونية للجليسين التي تسمح حقًا لمخزن التكديس بالقيام بعمله. الجلايسين هو حمض أميني بالصيغة الكيميائية NH2-CH2-COOH. شحنة أيونها تعتمد على الرقم الهيدروجيني للمحلول الموجود فيه. في البيئات الحمضية ، تصبح نسبة أكبر من جزيئات الجليسين موجبة الشحنة. عند درجة حموضة محايدة تبلغ حوالي 7 ، يكون الأيون غير مشحون (zwitterion) ، له شحنة موجبة وشحنة سالبة. عند ارتفاع درجة الحموضة ، يصبح الجلايسين أكثر سالبة الشحنة.

    ما علاقة شحنة الجليسين بطبقة التكديس؟
    كل شىء. يوجد الجلايسين في المخزن المؤقت للتشغيل ، والذي يكون عادةً عند درجة الحموضة 8.3. عند هذا الرقم الهيدروجيني ، يكون الجلايسين سالبًا في الغالب ، مكونًا الأنيونات الجلايسينية. عندما يتم تطبيق مجال كهربائي ، تضرب الأنيونات الجليسينية درجة الحموضة 6.8 عازلة التراص ، وتتغير لتصبح في الغالب zwitterions جليكاين محايدة الشحنة. هذا يعني أنها تتحرك ببطء عبر طبقة التراص باتجاه القطب الموجب بسبب نقص شحنتها.

    على النقيض من ذلك ، تتحرك الأيونات (من Tris-HCl في الهلام) بمعدل أسرع نحو الأنود. عندما تضرب zwitterions Cl- و glycine آبار التحميل مع عينات البروتين الخاصة بك ، فإنها تخلق تدرج جهد ضيق ولكن حاد بين جبهة Cl-ion عالية الحركة (الأيونات الرائدة) وأبطأ حركة glycine zwitterion الأمامية (الأيونات الزائدة) ). تقع القدرات الكهربائية للبروتينات في عينتك في مكان ما بين هذين النقيضين ، وبالتالي تتركز البروتينات في هذه المنطقة ويتم تجميعها من خلال هلام التراص بين جبهتي zwitterion Cl- و glycine.

    ماذا يحدث ل glycine zwitterion في طبقة التحليل؟
    يصبح سلبيًا حقيقيًا ، سريعًا حقيقيًا. عندما تصطدم جبهات Cl- و glycine zwitterion بطبقة التحليل عند درجة حموضة 8.8 ، تكتسب أيونات الجلايسين الكثير من الشحنات السالبة. لم تعد في الغالب محايدة وتقلع باتجاه القطب الموجب المشحون مثل الأنيونات الجلايسينية. لا تتأثر ببولي أكريلاميد ، فإنها تتخطى طبقة البروتين ، وتودع البروتينات في شريط ضيق في الجزء العلوي من الطبقة الذائبة.


    عندما يتم فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربي من خلال مصفوفة هلامية ، فإن البروتينات الأصغر تهاجر بشكل أسرع بسبب مقاومة أقل من مصفوفة الهلام. تشمل التأثيرات الأخرى على معدل الهجرة عبر مصفوفة الهلام بنية البروتينات وشحنها.

    في SDS-PAGE ، يزيل استخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS ، المعروف أيضًا باسم كبريتات لوريل الصوديوم) وهلام بولي أكريلاميد إلى حد كبير تأثير الهيكل والشحنة ، ويتم فصل البروتينات فقط بناءً على طول سلسلة البولي ببتيد.

    SDS هو منظف له تأثير قوي على تغيير طبيعة البروتين ويرتبط بالعمود الفقري للبروتين بنسبة مولارية ثابتة. في وجود SDS وعامل الاختزال الذي يشق روابط ثاني كبريتيد ضرورية للطي المناسب ، تتكشف البروتينات في سلاسل خطية ذات شحنة سالبة تتناسب مع طول سلسلة البولي ببتيد.

    تشكل مادة الأكريلاميد المبلمرة (بولي أكريلاميد) مصفوفة تشبه الشبكة مناسبة لفصل البروتينات ذات الحجم النموذجي. قوة الجل تسمح بسهولة التعامل. يسمح الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد للبروتينات المعالجة بـ SDS للباحثين بفصل البروتينات بناءً على طولها بطريقة سهلة وغير مكلفة ودقيقة نسبيًا.


    الكتلة الجزيئية مقابل الوزن الجزيئي

    يتم التعبير عن الكتلة الجزيئية (الرمز m) في Daltons (Da). يُعرّف دالتون واحد بأنه 1/12 من كتلة الكربون 12. معظم الجزيئات كبيرة بما يكفي لاستخدام كيلو دالتون (كيلو دالتون) لوصف الكتلة الجزيئية. الوزن الجزيئي ليس هو نفسه الكتلة الجزيئية. يُعرف أيضًا باسم الكتلة الجزيئية النسبية (الرمز Mr ، حيث r عبارة عن حرف منخفض). يُعرَّف الوزن الجزيئي بأنه نسبة كتلة الجزيء الكبير إلى 1/12 من كتلة ذرة كربون 12. إنها كمية بلا أبعاد.

    عندما يعطي الأدب كتلة في Da أو kDa فإنه يشير إلى الكتلة الجزيئية. من الخطأ التعبير عن الوزن الجزيئي (الكتلة الجزيئية النسبية) في دالتون. ومع ذلك ، ستجد مصطلح الوزن الجزيئي المستخدم مع Daltons أو kiloDaltons في بعض الأدبيات ، وغالبًا ما يستخدم الاختصار MW للوزن الجزيئي.


    ما الفرق بين التيار الثابت والجهد الثابت والقوة الثابتة؟

    نظرًا لأن ظروف الهلام والعازل والعينة يمكن أن تتغير أثناء خطوات الفصل الكهربائي ، فإن معظم حزم الطاقة الحديثة توفر مجموعة متنوعة من الخيارات للحفاظ على الجهد المستمر والتيار الثابت (أمبير) والطاقة الثابتة (واط). قبل الانتقال إلى بعض الإعدادات الموصى بها ، إليك تجديد سريع حول أساسيات الدوائر الكهربائية:

    الجهد (V) - الفرق في الجهد الكهربائي بين شحنتين - هو المعلمة الأساسية لتحديد السرعة التي سيتحرك بها البروتين خلال الهلام أثناء SDS-PAGE. إذا كنت تفكر في الكهرباء مثل برج الماء ، فإن الجهد هو ضغط الماء الناتج عن وضع الماء على ارتفاع معين. كلما زاد الجهد ، زاد "الضغط" الكهربائي وستعمل البروتينات بشكل أسرع.

    يشير التيار (I) إلى تدفق الشحنة الكهربائية بعد نقطة في الدائرة. باستخدام نفس التشبيه المائي كما هو مذكور أعلاه ، فإن التيار هو معدل تدفق الماء عبر الأنبوب.

    الطاقة (P) - التي تُعرّف عمومًا على أنها العمل المنجز لكل وحدة زمنية - تساوي ببساطة الجهد مضروبًا في التيار ، والذي يمكن كتابته على هذا النحو:

    أحد المعلمات الإضافية التي يجب مراعاتها هي المقاومة (R) ، والتي (كما يوحي الاسم) هي مقياس لمدى صعوبة مرور الشحنة عبر الموصل. في النشاف الغربي ، المقاومة هي مقياس مدى كفاءة الأيونات الموجودة في المخزن المؤقت SDS-PAGE الخاص بك في السماح للشحنة "بالتدفق" عبر الهلام.

    المقاومة مرتبطة بالجهد والتيار بقانون أوم:


    • خدمات
      • التوثيق والتحليل الهلامي أحادي الأبعاد وثنائي الأبعاد
      • 2-D الكهربائي للهلام
      • جهاز استشراب سائل عالي الأداء (HPLC)
      • خدمات الورم الهجين
      • في الهلام وحل الهضم
      • التركيز الكهروضوئي (IEF)
      • تحليل الكتلة MALDI
      • تخليق الببتيد
      • تسلسل البروتين / الببتيد
      • Q مطياف الكتلة الترادفية الفائقة (LC-MS / MS)
      • SDS-PAGE و Electroblotting
      • Synapt G2-Si HDMS
      • نظام تصوير تايفون
      • إنشاء استمارات التقديم
      • الندوات القادمة
      • الندوات السابقة
      • كتيبات
      • أخبار
      • معلومة اضافية

      SDS-PAGE و Electroblotting

      نحن نستخدم حاليًا نظام خلايا Mini-PROTEAN II ثنائي الألواح ونظام خلية نقل كهربي عبر لطخة صغيرة ، وكلاهما من مختبرات Bio-Rad.

      فيما يلي وصف عام لـ SDS-PAGE والتنشيف لتحليل الأحماض الأمينية وتسلسل البروتين الطرفي N.

      SDS-PAGE
      يعتبر الرحلان الكهربائي لجيل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) في وجود عامل الاختزال (2-مركابتوإيثانول) تقنية لفصل الوحدات الفرعية متعددة الببتيد وفقًا لوزنها الجزيئي. يتضمن البروتوكول تغيير طبيعة عينة البروتين عن طريق تسخينها في وجود SDS وعامل اختزال. سوف يرتبط SDS بالبروتين مما يؤدي إلى تكشفته ، في حين أن عامل الاختزال سوف يقلل من روابط ثاني كبريتيد داخل الجزيء وبين الجزيئات. يمنح ارتباط SDS بالبروتين شحنة سالبة صافية وسوف ينتقل متعدد الببتيد المشوه من خلال هلام من نسبة الأكريلاميد المعروفة في وجود مجال كهربائي مطبق باتجاه القطب الموجب (الأنود). بعد اكتمال الرحلان الكهربي ، يتم تلوين الجل بـ Coomassie "Blue R-250 لتصور نطاقات البولي ببتيد. الوزن الجزيئي للبولي ببتيد يتناسب عكسًا مع حركته. يمكن تقدير الوزن الجزيئي للوحدة الفرعية متعددة الببتيد مباشرة من semilog رسم بياني للوزن الجزيئي للبروتينات القياسية مقابل حركتها أو من مخطط لوغاريتم الوزن الجزيئي مقابل التنقل. يعتبر فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE تقنية ممتازة لإنتاج البروتينات "المنقاة" بشكل فردي.

      اليكتروبلوتينغ
      النشاف هو تقنية لنقل الدنا أو الحمض النووي الريبي أو البروتين الكهربائي إلى غشاء مناسب. الطريقة الأكثر شيوعًا المستخدمة في النقل الكهربائي للبروتينات إلى النيتروسليلوز هي تلك التي ذكرها Towbin وآخرون. (1979). من أجل الاستفادة من هذه التقنية لغرض تحليل الأحماض الأمينية أو تسلسل N-terminal ، يجب نقل البروتينات إلى غشاء مستقر للمواد الكيميائية المستخدمة في هذه الإجراءات التحليلية. لتسلسل البروتين وتحليل الأحماض الأمينية ، يتم نقل البروتينات إلى غشاء مستقر كيميائيًا ، بولي فينيلدين ديفلورايد (PVDF). في مختبرنا نستخدم تقنية النقل "الرطب" بدلاً من تقنية النقل "الجاف". يتم فصل البروتينات أولاً بواسطة SDS-PAGE ، تتم إزالة الجل من شريط الرحلان الكهربائي (لا تلطخ الجل قبل النشاف) وتتم معايرته في مخزن مؤقت للنقل بدون ميثانول. يتم "تنشيط" غشاء PVDF عن طريق غمسه في الميثانول ثم يتم وضعه في محلول نقل يحتوي على الميثانول. يتم وضع شطيرة gel-PVDF في حامل مصمم خصيصًا يتم وضعه بدوره في وحدة الفصل الكهربائي المحتوية على المخزن المؤقت. عند الرقم الهيدروجيني للعازل (pH 8.3) ، فإن معظم البروتينات مشحونة سلبًا وستنتقل إلى القطب الموجب (القطب الموجب). في حالة الاشتباه في أن البروتين يحتوي على pI أكبر من 8.3 ، يمكن وضع غشاء PVDF في جانب الكاثود من الجل أيضًا. وبدلاً من ذلك ، يمكن تعديل درجة الحموضة في المخزن المؤقت للنقل إلى درجة حموضة أعلى. بعد النقل ، يتم تلطيخ الغشاء بـ Coomassie Blue R-250 ومخصص لتحديد عصابات البروتين. يمكن بعد ذلك استئصال المقاطع التي تحتوي على نطاقات البروتين لتحليل الأحماض الأمينية وتسلسل البروتين الطرفي N.

      • SDS-PAGE "Hall of Shame" من جامعة رايس - أمثلة على المواد الهلامية التي لم تعمل بشكل صحيح والسبب
      • المواد الهلامية الملطخة من جامعة رايس - أمثلة على المواد الهلامية الملطخة والأسباب
      • إنشاء استمارة التقديم

      مرفق الاتصال

      بريد الالكتروني:
      هاتف: (515) 294-3267
      فاكس: (515) 294-7629

      ساعات المنشأة

      الاتجاهات

      معلومات الخدمة

      رسائل المنشأة

      سيكون موظفو المنشأة غير متاحين في الفترة من 8 إلى 16 يونيو.
      لن تتم معالجة معظم طلبات العينات خلال هذه الفترة الزمنية. سيظل المرفق مفتوحًا للوصول إلى الأجهزة التي يديرها المستخدم ولكن المساعدة ستكون محدودة. نحن نعتذر عن أي إزعاج قد يسببه هذا الأمر. يرجى التخطيط وفقًا لذلك.

      -> مارس 16 ، 2020
      نظرًا للقلق المتزايد بشأن فيروس كورونا الجديد COVID-19 ، ستظل منشأة البروتين بجامعة ولاية أيوا مفتوحة ، لكن الوصول إلى المنشأة سيقتصر على موظفي المنشأة فقط حتى إشعار آخر.
      لتسليم العينات أو استخدام Typhoon أو Denovix DS-11 ، يرجى الاتصال بالرقم 294-3267 أو البريد الإلكتروني [email protected] لاتخاذ الترتيبات المناسبة.

      يرجى مراجعة صفحة معلومات COVID-19 الخاصة بالجامعة على https://web.iastate.edu/safety/updates/covid19 وصفحة الويب الخاصة بنا (www.protein.iastate.edu) لمزيد من التحديثات والتغييرات.

      3 يوليو 2019
      نقل خدمات الورم الهجين إلى منشأة البروتين المزيد.

      15 مارس 2018
      تحليل البيانات البروتينية المزيد.

      31 أغسطس 2017
      تثبيت IM-MS الجديد المزيد.

      5 يوليو 2017
      nano-LC الجديد مثبت المزيد.

      30 مايو 2017
      جهاز التسلسل الجديد مثبت المزيد.

      19 أبريل 2017
      MALDI الجديدة المثبتة المزيد.

      27 يونيو 2016
      تستحوذ منشأة البروتين على برنامج للبروتيوميات الكمية. أكثر.

      24 أغسطس 2015
      تم إيقاف خدمة ازدواج اللون الدائري (CD) ، انظر هنا للحصول على التفاصيل.

      22 يناير 2015
      تستحوذ منشأة البروتين على Q Exactive & Trade مطياف الكتلة الهجين الرباعي Orbitrap من Thermo Scientific. أكثر.

      12 يونيو 2014
      تثبيت جديد Typhoon FLA 9500. أكثر . ->

      مرفق البروتين في مكتب التكنولوجيا الحيوية بجامعة ولاية آيوا
      1178 مبنى البيولوجيا الجزيئية ، 2437 Pammel Dr.، Ames، IA 50011-1079
      الهاتف: 515-294-3267 ، البريد الإلكتروني:

      حقوق النشر والنسخ 1995-2021 ، جامعة ولاية آيوا للعلوم والتكنولوجيا. كل الحقوق محفوظة.


      شاهد الفيديو: SDS PAGE Principle and the Use of Discontinuous buffer system (شهر فبراير 2023).