معلومة

4.4.1: ثقافة دفعة من البكتيريا - علم الأحياء

4.4.1: ثقافة دفعة من البكتيريا - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تتطلب مزارع الجراثيم خلايا مضيفة يتكاثر فيها الفيروس أو العاثية.

أهداف التعلم

  • تحديد أسباب وطرق استنبات العاثيات المزروعة على دفعات

النقاط الرئيسية

  • العاثية هي نوع من الفيروسات التي تصيب البكتيريا. يقوم بذلك عن طريق حقن مادة وراثية - إما DNA أو RNA - والتي تحملها داخل قفيصة بروتين خارجية.
  • لدخول الخلية المضيفة ، تلتصق العاثيات بمستقبلات محددة على سطح البكتيريا ، بما في ذلك عديدات السكاريد الدهنية أو أحماض تيكويك أو البروتينات أو حتى الأسواط.
  • لا تتحرك فيروسات العاثيات بشكل مستقل ، بل يجب أن تعتمد على لقاءات عشوائية مع المستقبلات الصحيحة عندما تكون في المحلول (الدم ، الدورة اللمفاوية ، الري ، مياه التربة ، إلخ).

الشروط الاساسية

  • عاثية: فيروس يصيب البكتيريا على وجه التحديد.

استراتيجيات النسخ المتماثل

تتطلب مزارع الفيروسات أو العاثيات خلايا مضيفة لتتكاثر فيها. بالنسبة للعاثيات ، تزرع الثقافات عن طريق إصابة الخلايا البكتيرية. يمكن بعد ذلك عزل العاثية عن اللويحات الناتجة في حشيش البكتيريا على طبق.

العاثية هي أحد الفيروسات التي تصيب البكتيريا. يفعلون ذلك عن طريق حقن مادة وراثية ، تحملها داخل قفيصة بروتين خارجية ، في خلية بكتيرية مضيفة. يمكن أن تكون المادة الوراثية ssRNA أو dsRNA أو ssDNA أو dsDNA (تشير بادئة "ss-" أو "ds-" إلى حبلا مفرد أو حبلا مزدوجًا) ، جنبًا إلى جنب مع الترتيبات الدائرية أو الخطية.

لدخول الخلية المضيفة ، تلتصق العاثيات بمستقبلات محددة على سطح البكتيريا ، بما في ذلك عديدات السكاريد الدهنية أو أحماض تيكويك أو البروتينات أو حتى الأسواط. تعني هذه الخصوصية أن العاثية لا يمكنها إصابة سوى تلك البكتيريا الحاملة للمستقبلات التي يمكنها الارتباط بها ، والتي بدورها تحدد نطاق مضيف العاثية. تؤثر ظروف نمو المضيف أيضًا على قدرة العاثية على الارتباط بها وغزوها. نظرًا لأن فيريونات العاثية لا تتحرك بشكل مستقل ، يجب أن تعتمد على لقاءات عشوائية مع المستقبلات الصحيحة عندما تكون في محلول داخل الدم ، أو الدورة اللمفاوية ، أو الري ، أو مياه التربة ، أو بيئات أخرى ..

يمكن إطلاق العاثيات عن طريق تحلل الخلايا أو بالبثق أو في حالات قليلة عن طريق التبرعم. يتحقق التحلل ، عن طريق العاثيات الذيلية ، عن طريق إنزيم يسمى إندوليزين ، الذي يهاجم ويكسر جدار الخلية الببتيدوغليكان. نوع مختلف تمامًا من العاثيات ، العاثيات الخيطية ، تجعل الخلية المضيفة تفرز باستمرار جزيئات فيروس جديدة. توصف الفيروسات المطلقة بأنها حرة ، وما لم تكن معيبة ، فهي قادرة على إصابة بكتيريا جديدة. يرتبط التبرعم ببعض لاقمات الميكوبلازما. على عكس إطلاق virion ، لا تقتل العاثيات التي تظهر دورة ليسوجينية العائل ، بل تصبح مقيمًا على المدى الطويل كقوات.


انتاج المضادات الحيوية | علم الأحياء الدقيقة الصناعية

تقدم المقالة المذكورة أدناه لمحة عامة عن إنتاج المضادات الحيوية: - 1. مقدمة في المضادات الحيوية 2. استخدام اللقاح في إنتاج المضادات الحيوية 3. استخدام التخمير 4. متوسطة مستعملة 5. الإستقلاب.

مقدمة عن المضادات الحيوية:

المضادات الحيوية هي مستقلبات لها نشاط تفضيلي مضاد للميكروبات. لذلك ، فهي تستخدم على نطاق واسع لعلاج الأمراض البشرية التي تسببها الكائنات الحية الدقيقة. لكن بعض المضادات الحيوية لها نشاط مضاد للورم أيضًا (الجدول 40.1). تم اكتشاف البنسلين المضاد الحيوي بواسطة Fleming في عام 1929 ، لكن إنتاجه التجاري لم يبدأ إلا في أوائل الأربعينيات.

على الرغم من عزل أكثر من 7000 مركب مضاد حيوي ، يتم استخدام 100 مركب فقط أو نحو ذلك لعلاج أمراض الإنسان والحيوان والنبات.

تستخدم مركبات المضادات الحيوية إما في شكلها الطبيعي أو كمشتقات شبه اصطناعية ، وعادة ما ينتج القوس الأخير عن طريق عزل نواة المضادات الحيوية وتعريضها للتعديل الكيميائي. يتم إنتاج المضادات الحيوية عن طريق كل من الفطريات والبكتيريا ، ولكن يتم الحصول على أكثر من 50 ٪ منها من Streptomyces وحدها.

استخدام اللقاح في إنتاج المضادات الحيوية:

تعتبر السلالة عالية الإنتاجية شرطًا أساسيًا لإنتاج المضادات الحيوية. لذلك ، يعد التحسين المستمر للضغط جزءًا لا يتجزأ من أنشطة الإنتاج التجاري. يتم الاحتفاظ بالسلالة / السلالات المحسّنة في تخزين طويل الأجل ، حيث يتم أخذ أصغر كمية منها لبدء تطوير اللقاح.

يبدأ تطوير اللقاح على الوسائط الصلبة ، وبعد ذلك يتم استخدام الوسائط السائلة المستخدمة في تطوير اللقاح. يتم تحضير اللقاح عادة في شكل معلق بوغ ، والذي يتم نقله إلى المخمر عن طريق وضعه في وعاء معدني متصل بالمخمر.

يمكن نفخ معلق البوغ في المخمر باستخدام هواء معقم أو قد يُسمح له بالركض تحت الجاذبية. كقاعدة عامة ، يتم الاحتفاظ بعدد المراحل بين المادة المحفوظة ومرحلة التلقيح النهائية إلى الحد الأدنى لتقليل مخاطر فقدان الكائن الحي لإمكاناته عالية الإنتاجية.

استخدام التخمير في إنتاج المضادات الحيوية:

يتم إنتاج المضادات الحيوية بشكل عام في أجهزة تخمير من الصلب غير القابل للصدأ (30.000-200.000 1 حجم متوسط) تستخدم في وضع الدُفعات أو الدُفعات. يتم التحريض في الغالب بواسطة الدفاعات ، ولكن يتم أيضًا استخدام نظام رفع الهواء. غالبًا ما يستخدم تبريد الماء للحفاظ على درجة الحرارة بين 24-26 درجة مئوية لمعظم منتجي المضادات الحيوية.

بشكل عام ، يتم الحفاظ على المخمر عند ضغط أعلى من الضغط الجوي وهذا يقلل من مخاطر التلوث ويعزز O2 العرض في المتوسط. يتم توفير الهواء المعقم حسب الحاجة ، وبالنسبة لبعض العمليات ، على سبيل المثال ، إنتاج البنسلين ، يجب إضافة المواد طوال العملية. في معظم الحالات ، من الضروري منع التلوث ، ويجب الالتزام بإجراءات التنظيف المناسبة بين عمليات التخمير.

يفضل استخدام مخمر المرحلة النهائية لإنتاج المضادات الحيوية لأطول فترة ممكنة. لكن المراحل الأولى من التخمير مصممة لنمو جرثومي كبير ، وعادة ما يتم إجراؤها في مخمرات مرحلة البذور ذات حجم أصغر.

يمكن استخدام مرحلة بذرة واحدة أو أكثر ، اعتمادًا على العملية والسلالة ، لإنتاج أكبر قدر من الكتلة الحيوية في الحالة الفسيولوجية الصحيحة لإنتاج المضادات الحيوية العالية عند إدخالها في المرحلة النهائية من التخمير.

وسط يستخدم لإنتاج المضادات الحيوية:

يستخدم إنتاج المضادات الحيوية مجموعة متنوعة من الوسائط ، مختلفة لكل مرحلة من مراحل العملية (الجدول 40.2). يتم توجيه جهد بحثي كبير نحو تطوير مرحلة البذور ووسائط الإنتاج لتقليل التكاليف وتعزيز الغلات. يحتوي وسط الإنتاج النموذجي على حوالي 10٪ (وزن / حجم) من المواد الصلبة.

بشكل عام ، تكون الغلة أعلى بكثير على الوسائط المعقدة. في بعض الحالات ، يتم أيضًا توفير مادة سليفة مناسبة للمضاد الحيوي ، على سبيل المثال ، لإنتاج البنسلين G ، يتم استخدام حمض فينيل أسيتيك أو حمض فينوكسي أسيتيك كسلائف.

نظرًا لأن المضادات الحيوية عبارة عن مستقلبات ثانوية ، فقد تم تصميم وسط الإنتاج بحيث تصبح العناصر الغذائية الرئيسية محدودة في مرحلة حرجة لبدء عملية التمثيل الغذائي الثانوية في الكائن الحي. يعتمد الحد من المغذيات على العملية ، على سبيل المثال ، الجلوكوز لإنتاج البنسلين والفوسفات للعديد من المضادات الحيوية التي تنتجها Streptomyces.

في المقابل ، تم تصميم وسط مرحلة البذور للنمو السريع ، ولمنع إنتاج المضادات الحيوية وتكوُّن الأبواغ. عندما تصل زراعة البذور إلى المرحلة الصحيحة ، أي المرحلة المناسبة للإنتاج الأمثل في مرحلة الإنتاج النهائية (في كثير من الحالات ، تكون مرحلة اللوغاريتمات) ، يتم نقل حوالي 0.1-20٪ من حجم المرحلة النهائية إلى مخمر الإنتاج . يعد التحكم الصارم في التلوث أمرًا ضروريًا في هذه المرحلة.

في معظم عمليات الإنتاج ، يتم تشغيل مخمر الإنتاج في وضع التغذية بنظام الدُفعات التي يتم فيها إضافة عنصر غذائي ، مثل الجلوكوز ، بشكل مستمر خلال عملية التخمير لتعزيز مدة إنتاج المضادات الحيوية. في مثل هذه الحالة ، عادة ما يتم سحب كميات صغيرة من المرق للتحقق من زيادة حجم المرق في المخمر.

تتم إضافة عوامل مضادة للرغوة في المرحلة المناسبة من التخمير لتقليل السيليكون الرغوي والزيوت النباتية وما إلى ذلك ، وتستخدم لهذا الغرض. يتم رصد السمات الميكروبيولوجية والفيزيائية والكيميائية المختارة أثناء التخمير من أجل تحقيق التحكم المناسب في العملية.

تتم مراقبة الحالة التغذوية للمرق بانتظام لضبط المغذيات والسلائف (إن وجدت) التغذية في أنظمة العلف. تُستخدم المعالجات الدقيقة وأجهزة الكمبيوتر بشكل شائع لتسجيل جميع المعلمات وتغييرات العملية ، وللتحكم في العمليات المختلفة مثل التعقيم ، إلخ.

في نهاية مرحلة الحضانة النهائية للإنتاج ، يحتوي المرق على تركيز منخفض فقط (3-35٪ من إجمالي المواد المذابة في المرق) من المضاد الحيوي.

الخطوة الأولى في استعادة المضادات الحيوية هي فصل الخلايا عن المرق ويتم ذلك عادة عن طريق الترشيح أو الطرد المركزي. ولكن في بعض الحالات ، يتم استخدام مرق كامل للاستخراج. يستخدم عزل وتنقية المضادات الحيوية استخراج المذيبات ، والتبادل الأيوني ، والترشيح الفائق ، والتناضح العكسي ، والترسيب ، والتبلور.


مقدمة

من المعروف أن الفيروسات تؤثر على معدل الوفيات بدائية النواة والدورات البيوجيوكيميائية ، ولديها تنوع جيني كبير في النظم البيئية البحرية (Fuhrman ، 1999 Suttle ، 2005). إنها أكثر العوامل البيولوجية وفرة على وجه الأرض ، لذلك تتأثر البيئة الميكروبية في جميع البيئات بشكل كبير بالفيروسات. احتوت المياه الجوفية العميقة في الصخور الجرانيتية في مختبر Äspö Hard Rock (HRL) على 10 4-10 6 خلايا مل -1 (Pedersen ، 2001) ، وفي الواقع ، من المحتمل أن تتجاوز كتلة بدائيات النوى تحت السطحية كتلة النبات والحياة بدائية النواة في البيئات السطحية (ويتمان وآخرون ، 1998). كايل وآخرون (2008) أبلغت عن أعداد مجهرية الفلورسنت للجسيمات الشبيهة بالفيروسات في نطاق 10 5-10 7 مل -1 من المياه الجوفية في Äspö HRL من أعماق 69-455 مترًا ومجموعة فيروسية متنوعة شكليًا عند عرضها تحت المجهر الإلكتروني النافذ (تيم). تجاوز عدد الفيروسات في المياه الجوفية Äspö عدد الخلايا بترتيب واحد من حيث الحجم ، وهي نسبة توجد بشكل متكرر في البيئات السطحية النشطة (Kutter and Sulakvelidze، 2005 Suttle، 2005).

يعتبر الافتقار إلى تركيز الكتلة الحيوية الميكروبية الكبيرة في البيئات داخل كوكب الأرض دليلًا على أن الكائنات الحية الدقيقة الموجودة غير نشطة أو يتم استقلابها ببطء شديد (كير ، 2002). يقدم وجود الفيروسات تفسيرًا بديلاً ، حيث تتحكم الفيروسات في التجمعات الميكروبية النشطة في البيئات العميقة داخل كوكب الأرض. يطلق التحلل الفيروسي للخلايا البكتيرية مواد مغذية ، مما يساهم بشكل كبير في التمثيل الغذائي للميكروبات في النظم البيئية القاعية في أعماق البحار (Danovaro et al. ، 2008). ومع ذلك ، فإن نشاط مثل هذه الفيروسات اللايتية في المياه الجوفية العميقة لم يتم تأكيده عن طريق الزراعة والعزل.

المياه الجوفية العميقة في الصخور الجرانيتية لا هوائية وتحتوي على العديد من مجموعات التمثيل الغذائي من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك البكتيريا التي تقلل الكبريتات (SRB) (Hallbeck and Pedersen ، 2008). غالبًا ما كانت الفيروسات الموجودة في البيئات الطبيعية خاصة بالأنواع (Suttle ، 2005) ويمكن عزلها عن البيئات التي تم العثور فيها على المضيف. العاثيات التي تصيب ثلاثة أنواع من الكبريتات ديسولفوفيبريو تم الإبلاغ عنها سابقًا: وجد Rapp and Wall (1987) العاثيات التي يمكن أن تتوسط التنبيغ في ديسولفوفيبريو ديسولفوريكان تم عزل العاثيات اللايسوجينية المستحثة بالميتوميسين C من Desulfovibrio vulgaris بواسطة Handley et al. (1973) ووكر وآخرون. (2006) و Kamimura و Araki (1989) عزلوا العدوى بالعاثية ديسولفوفيبريو سالكسيجينز.

تم اختبار نشاط العاثيات في المياه الجوفية Äspö HRL هنا باستخدام Desulfovibrio aespoeensis كمضيف. تم عزل هذه البكتيريا من Äspö HRL ووصفت قبل 10 سنوات (Motamedi and Pedersen ، 1998). تم إثرائه مرارًا وتكرارًا من المياه الجوفية Äspö HRL وتم تحديده من خلال تسلسل الجين 16S rRNA (Pedersen et al. ، 1996 Fru and Athar ، 2008). وبالتالي كان هناك دليل قوي على ذلك D. aespoeensis هو أحد الأنواع المحلية في المياه الجوفية العميقة لـ Äspö HRL. نقدم هنا تقريرًا عن مدى إصابة العاثيات D. aespoeensis في Äspö HRL ، تم تحليلها باستخدام تقنية الرقم الأكثر احتمالاً (MPN). تم فحص عشرة آبار تتراوح أعماقها من 183 إلى 455 م. تم عزل العاثيات من ثقافات MPN ووصفت فيما يتعلق بالتشكل ومدى المضيف باستخدام ستة أنواع مختلفة من ديسولفوفيبريو، بالإضافة إلى عشر عزلات مختلفة من SRB من المياه الجوفية Äspö HRL. تمت متابعة نمو مزارع SRB و Phage وتم تحليل مناعة الخلايا لعزلات الملتهمة.


توليد الخلايا التائية الخاصة بالعديد من الفيروسات عن طريق تحفيز واحد للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي باستخدام خليط الببتيد باستخدام وسط خالٍ من المصل

خلفية: توفر استعادة المناعة الخاصة بالفيروس بواسطة الخلايا التائية الخاصة بالفيروس (VSTs) بديلاً جذابًا للأدوية التقليدية ، ويمكن أن تكون فعالة للغاية في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة ، بما في ذلك متلقي زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT). ومع ذلك ، يتطلب تصنيع VSTs التقليدية إعداد خلايا تقديم مستضد متخصصة (APCs) ، وزراعة طويلة خارج الجسم الحي في وسط يحتوي على مصل وإعادة تحفيز المستضد بالفيروسات أو النواقل الفيروسية لتوفير مستضدات فيروسية للعرض على APCs.

أساليب: لتبسيط هذه العملية المعقدة ، قمنا بتطوير طريقة لإنشاء VSTs متعددة عن طريق التحفيز المباشر للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) مع مكتبات الببتيد المتداخلة في وسط خالٍ من المصل.

نتائج: أنشأنا VSTs التي استهدفت سبعة فيروسات (الفيروس المضخم للخلايا [CMV] ، وفيروس إبشتاين بار [EBV] ، والفيروس الغدي [AdV] ، وفيروس الهربس البشري 6 [HHV-6] ، وفيروس BK [BKV] ، وفيروس JC [JCV] وفيروس Varicella Zoster [VZV]) في سطر واحد. كان النمط الظاهري والنمو والخصوصية للعديد من VSTs المنتجة في وسط خالٍ من المصل معادلة لتلك الناتجة في الوسط التقليدي المحتوي على المصل.

مناقشة: يسمح استخدام الوسط الخالي من المصل بإدخال هذا النهج بسهولة في الممارسة السريرية بتكلفة أقل ، وإمكانية استنساخ أكبر بسبب عدم وجود تباين دفعة إلى دفعة في مصل الدم ودون مخاوف بشأن العوامل المعدية في المصل المستخدم. سيتم الآن اختبار هذا النهج المبسط في متلقي مستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) المتطابق مع الأخوة HSCT.

الكلمات الدالة: الخلايا الليمفاوية التائية زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم المستنبتات الخالية من المصل المستضدات الفيروسية المتوسطة الأمراض الفيروسية.


طرق تعقيم الوسائط والهواء (مع رسم بياني)

يمكن تعقيم المفاعل الحيوي عن طريق تدمير الكائنات الحية عن طريق الحرارة / المواد الكيميائية / الإشعاع أو أحيانًا عن طريق الإجراءات الفيزيائية مثل الترشيح.

تتم مناقشة تعقيم الوسائط والهواء أدناه:

1. تعقيم وسائل الإعلام الثقافية:

تساهم مكونات وسط الاستزراع والماء والأوعية في التلوث بالخلايا والجراثيم النباتية. يجب أن تكون الوسائط خالية من التلوث قبل استخدامها في التخمير. يتم تعقيم الوسائط بشكل أكثر شيوعًا عن طريق تطبيق الحرارة وبدرجة أقل بوسائل أخرى (الطرق الفيزيائية والمعالجة الكيميائية والإشعاع).

التعقيم الحراري:

الحرارة هي تقنية التعقيم الأكثر استخدامًا. تعتبر جودة وكمية التلوث (أي نوع وحمل الكائنات الدقيقة) ، وتكوين الوسائط ودرجة الحموضة وحجم الجسيمات المعلقة من العوامل المهمة التي تؤثر على نجاح التعقيم الحراري.

بشكل عام ، يتم تدمير الخلايا النباتية عند درجة حرارة منخفضة في وقت قصير (حوالي 60 درجة مئوية في 5-10 دقائق). ومع ذلك ، فإن تدمير الجراثيم يتطلب درجة حرارة أعلى ووقتًا أطول نسبيًا (حوالي 80 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة). تعتبر جراثيم Bacillus stearothermophilus هي الأكثر مقاومة للحرارة. في الواقع ، يتم استغلال هذا الكائن الحي لاختبار عقم معدات التخمير.

الطرق الفيزيائية:

الأساليب الفيزيائية مثل الترشيح والطرد المركزي والامتزاز (لمبادلات الأيونات أو الكربون المنشط) قيد الاستخدام. من بين هؤلاء ، يتم استخدام الترشيح على نطاق واسع. بعض المكونات (الفيتامينات ، ومكونات الدم ، والمضادات الحيوية) لوسط المزرعة قابلة للتأثر بالحرارة ، وبالتالي يتم تدميرها بالتعقيم الحراري. يتم إذابة هذه المكونات من الوسط تمامًا (ضرورية للغاية وإلا ستتم إزالتها مع الكائنات الحية الدقيقة) ثم تعقيمها بالترشيح.

هناك نوعان من قيود تقنية الترشيح:

1. تطبيق الضغط العالي في الترشيح غير مناسب للصناعات.

2. قد تفقد بعض مكونات الوسائط من الوسائط أثناء الترشيح.

في بعض الأحيان ، يتم استخدام مزيج من الترشيح والتعقيم الحراري. على سبيل المثال ، يتم ترشيح المياه المستخدمة في تحضير الوسائط بينما يتعرض محلول المغذيات المركز للتعقيم الحراري. يتم الآن إضافة الماء المصفى للتخفيف المناسب للوسائط. لا تُستخدم الطرق الكيميائية (باستخدام المطهرات) وإجراءات الإشعاع (باستخدام الأشعة فوق البنفسجية والأشعة السينية والأشعة السينية) بشكل شائع لتعقيم الوسائط.

تخضع وسائط الاستنبات للتعقيم عند 121 درجة مئوية بأحجام دفعات ، في المفاعل الحيوي. يمكن إجراء التعقيم الدفعي عن طريق حقن البخار في الوسط (الطريقة المباشرة) أو حقن البخار في الملفات الداخلية (طريقة غير مباشرة). بالنسبة للتعقيم المباشر ، يجب أن يكون البخار نقيًا وخاليًا من جميع الإضافات الكيميائية (التي تأتي عادةً من عملية التصنيع بالبخار).

هناك نوعان من عيوب التعقيم الدفعي:

1. الإضرار بوسائل الإعلام الثقافية:

من الشائع حدوث تغيرات في المغذيات وتغير الأس الهيدروجيني وتغير لون وسط الاستنبات.

2. ارتفاع استهلاك الطاقة:

يستغرق الأمر بضع ساعات (2-4 ساعات) لكامل محتويات المفاعل الحيوي للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة (أي 120 درجة مئوية). 20-60 دقيقة أخرى لعملية التعقيم الفعلية ، يتبعها التبريد لمدة 1-2 ساعة. كل هذه العملية تنطوي على إهدار للطاقة ، وبالتالي فإن التعقيم الدفعي مكلف للغاية.

التعقيم المستمر:

يتم إجراء التعقيم المستمر عند 140 درجة مئوية لفترة زمنية قصيرة جدًا تتراوح من 30 إلى 120 ثانية. (هذا على عكس التخمر الدفعي الذي تم إجراؤه عند 121 درجة مئوية لمدة 20-60 دقيقة). يعتمد هذا على مبدأ أن الوقت اللازم لقتل الكائنات الحية الدقيقة يكون أقصر بكثير عند درجة حرارة أعلى. يتم التعقيم المستمر عن طريق الحقن المباشر للبخار أو بواسطة المبادلات الحرارية.

في كلتا الحالتين ، يتم رفع درجة الحرارة بسرعة كبيرة إلى 140 درجة مئوية ، ويتم الحفاظ عليها لمدة 30-120 ثانية. يوضح الشكل 19.7 مراحل عملية التعقيم المستمر ودرجات الحرارة المقابلة لها. المراحل المختلفة - المبادل ، السخان ، وحدة صيانة الحرارة ، استعادة الحرارة المتبقية ، التبريد والتخمير.

في عملية التعقيم المستمر ، يتم استخدام 3 أنواع من المبادلات الحرارية. يقوم أول مبادل حراري برفع درجة الحرارة إلى 90-1 20 درجة مئوية خلال 20-30 ثانية. يقوم المبادل الثاني برفع درجة الحرارة إلى 140 درجة مئوية ويحتفظ بها لمدة 30-120 ثانية. يقوم المبادل الحراري الثالث بخفض درجة الحرارة عن طريق التبريد في 20-30 ثانية القادمة. يعتمد الوقت الفعلي المطلوب للتعقيم على حجم الجسيمات العالقة. كلما كان الحجم أكبر ، كلما زاد الوقت المطلوب.

الميزة الرئيسية للتعقيم المستمر هي توفير حوالي 80-90٪ من الطاقة. ومع ذلك ، فإن القيد هو أن بعض المركبات الموجودة في الوسط المترسب (على سبيل المثال ، فوسفات الكالسيوم ، أكسالات الكالسيوم) بسبب الاختلافات الشديدة في درجات الحرارة التي تحدث في وقت قصير جدًا بين التعقيم والتبريد. تصبح وسائط المزرعة المحتوية على النشا لزجة في التعقيم المستمر وبالتالي لا يتم استخدامها.

2. تعقيم الهواء:

بشكل عام ، تتم عمليات التخمير الصناعية تحت تهوية قوية ومستمرة. للتخمير الفعال ، يجب أن يكون الهواء معقمًا تمامًا وخاليًا من جميع الكائنات الدقيقة والخجولة والجزيئات المعلقة. هناك تباين كبير في كمية الجسيمات المعلقة والميكروبات في الهواء الخارجي للغلاف الجوي.

قد تتراوح الكائنات الحية الدقيقة من 10-2000 / م 3 بينما قد تكون الجسيمات المعلقة 20-100،00 / م 3. من بين الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في الهواء ، تهيمن الجراثيم الفطرية (50٪) والبكتيريا سالبة الجرام (40٪). يمكن تعقيم الهواء أو الغازات الأخرى بالترشيح والحرارة والأشعة فوق البنفسجية وتنقية الغاز. من بين هذه ، يتم استخدام الحرارة والترشيح بشكل شائع.

(أ) تعقيم الهواء بالحرارة:

في السنوات الأولى ، تم تمرير الهواء فوق العناصر المسخنة كهربائياً وتعقيمه. لكن هذه تكلفة كبيرة ، وبالتالي فهي ليست قيد الاستخدام هذه الأيام.

(ب) تعقيم الهواء بالترشيح:

ترشيح الهواء هو أكثر أنواع التعقيم استخدامًا في صناعات التخمير.

عندما يتم تمرير الهواء من خلال الصوف الزجاجي الذي يحتوي على مرشحات العمق ، يتم محاصرة الجسيمات وإزالتها (الشكل 19.8). تتضمن تقنية الترشيح هذه في المقام الأول تأثيرات فيزيائية مثل القصور الذاتي والعرقلة والجاذبية والجاذبية الكهروستاتيكية والانتشار. يمكن تعقيم مرشحات الصوف الزجاجي بالبخار وإعادة استخدامها. ولكن هناك قيود على إعادة استخدامها لأن الصوف الزجاجي يتقلص ويتصلب عند التعقيم بالبخار. في السنوات الأخيرة ، يتم استخدام خراطيش مرشح الألياف الزجاجية (التي لا تحتوي على قيود مرشح الصوف الزجاجي).


عام

تحتفظ الخلايا الدبقية الدبقية البشرية المحولة بخصائص الخلايا الدبقية الدبقية الأولية. إنها تمثل مجموعات خلايا متجانسة يمكن نموها إلى أجل غير مسمى وقد تمثل نظامًا مناسبًا للتحليل الكيميائي الحيوي لوظائف الخلايا الدبقية الصغيرة. كما هو موضح في التجارب الأولية ، يمكنهم أيضًا دعم عمليات الانتقال اللاحقة التي من شأنها أن تسمح بدراسة تنظيم التعبير عن الجينات المنقولة المختلفة في الخلايا الدبقية الصغيرة.

مميزات

معاجلة البيانات

  1. تحقق من عدم وجود تسرب أو كسر في جميع الحاويات.
  2. قم بإزالة الخلايا المجمدة من عبوة الثلج الجاف وضع الخلايا على الفور عند درجة حرارة أقل من -130 درجة مئوية ، ويفضل أن يكون ذلك في بخار النيتروجين السائل ، حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

لضمان أعلى مستوى من الصلاحية ، قم بإذابة القارورة وابدأ الثقافة في أسرع وقت ممكن عند الاستلام. إذا كان التخزين المستمر للثقافة المجمدة ضروريًا عند الوصول ، فيجب تخزينها في طور بخار النيتروجين السائل وليس عند -70 درجة مئوية. التخزين في درجة حرارة -70 درجة مئوية يؤدي إلى فقدان الصلاحية.

  1. قم بإذابة القارورة عن طريق التحريك اللطيف في حمام مائي 37 درجة مئوية. لتقليل احتمالية التلوث ، احتفظ بالحلقة على شكل O والغطاء بعيدًا عن الماء. يجب أن يكون الذوبان سريعًا (حوالي دقيقتين).
  2. قم بإزالة القارورة من الحمام المائي بمجرد إذابة المحتويات ، وقم بإزالة التلوث عن طريق الغمس أو الرش بنسبة 70٪ من الإيثانول. يجب تنفيذ جميع العمليات من هذه النقطة فصاعدًا في ظل ظروف معقمة صارمة.
  3. نقل محتويات القارورة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 9.0 مل وسط ثقافة كاملة. وتدور بسرعة 125 × تقريبًا ز لمدة 5 إلى 7 دقائق.
  4. ريسوسبيند بيليه الخلية مع الوسيط الكامل الموصى به (انظر معلومات الدُفعات المحددة لنسبة التخفيف الموصى بها للثقافة). من المهم تجنب القلوية المفرطة للوسط أثناء استعادة الخلايا. يُقترح ، قبل إضافة محتويات القارورة ، وضع وعاء الاستنبات الذي يحتوي على وسط النمو الكامل في الحاضنة لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للوسيط بالوصول إلى الرقم الهيدروجيني الطبيعي (7.0 إلى 7.6). الرقم الهيدروجيني (7.0 إلى 7.6).
  5. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مناسبة. شركة 5٪2 يوصى باستخدام الوسيط الموصوف في ورقة المنتج هذه.
  1. إزالة وتجاهل الثقافة المتوسطة.
  2. اشطف طبقة الخلية لفترة وجيزة بـ 0.25٪ (وزن / حجم) من محلول التربسين- 0.53 ملي مولار EDTA لإزالة كل آثار المصل الذي يحتوي على مثبط التربسين.
  3. إضافة 2.0 إلى 3.0 مل من محلول التربسين- EDTA لقارورة ومراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب حتى يتم تفريق طبقة الخلية (عادة في غضون 5 إلى 15 دقيقة).
    ملاحظة: لتجنب التكتل ، لا تقم بتحريك الخلايا عن طريق ضرب أو هز القارورة أثناء انتظار انفصال الخلايا. يمكن وضع الخلايا التي يصعب فصلها عند 37 درجة مئوية لتسهيل التشتت.
  4. إضافة 6.0 إلى 8.0 مل من متوسط ​​النمو الكامل ونضح الخلايا بواسطة بيبيتينج بلطف.
  5. إضافة قسامات مناسبة من تعليق الخلية لأوعية الثقافة الجديدة.
    يمكن إنشاء الثقافات بين 1 × 10 4 و 4 × 10 4 خلايا قابلة للحياة / سم 2. لا تتجاوز 7 × 10 4 خلايا / سم 2.
  6. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية.

مواصفات مراقبة الجودة

تاريخ

إخلاء المسؤولية القانونية

يتم تقديم المنتج "كما هو" ويتم ضمان صلاحية منتجات ATCC & reg لمدة 30 يومًا من تاريخ الشحن ، بشرط أن يكون العميل قد قام بتخزين المنتج والتعامل معه وفقًا للمعلومات الواردة في ورقة معلومات المنتج ، والموقع الإلكتروني ، و شهادة تحليل. بالنسبة للثقافات الحية ، يسرد ATCC تركيبة الوسائط والكواشف التي ثبت أنها فعالة للمنتج. في حين أن الوسائط والكواشف الأخرى غير المحددة قد تؤدي أيضًا إلى نتائج مرضية ، فقد يؤثر التغيير في بروتوكولات ATCC و / أو البروتوكولات الموصى بها من قبل المودع على استعادة المنتج و / أو نموه و / أو وظيفته. إذا تم استخدام تركيبة وسيطة بديلة أو كاشف ، فإن ضمان ATCC للصلاحية لم يعد صالحًا. باستثناء ما هو منصوص عليه صراحة في هذه الوثيقة ، لا يتم تقديم أي ضمانات أخرى من أي نوع ، صريحة أو ضمنية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، أي ضمانات ضمنية خاصة بالتسويق أو الملاءمة لغرض معين أو التصنيع وفقًا لمعايير ممارسات التصنيع الجيدة (cGMP) والنموذجية والسلامة والدقة و / أو عدم الانتهاك.

هذا المنتج مخصص للاستخدام في الأبحاث المختبرية فقط. غير مخصص لأي استخدام علاجي حيواني أو بشري ، أو أي استهلاك بشري أو حيواني ، أو أي استخدام تشخيصي. يحظر أي استخدام تجاري مقترح بدون ترخيص من ATCC.

بينما تبذل ATCC جهودًا معقولة لتضمين معلومات دقيقة وحديثة في ورقة المنتج هذه ، لا تقدم ATCC أي ضمانات أو إقرارات فيما يتعلق بدقتها. يتم توفير الاستشهادات من المؤلفات العلمية وبراءات الاختراع لأغراض إعلامية فقط. لا تضمن ATCC تأكيد صحة هذه المعلومات أو اكتمالها ويتحمل العميل وحده مسؤولية تأكيد دقة واكتمال أي من هذه المعلومات.

يتم إرسال هذا المنتج بشرط أن يكون العميل مسؤولاً ويتحمل جميع المخاطر والمسؤوليات فيما يتعلق باستلام منتج ATCC ومناولته وتخزينه والتخلص منه واستخدامه بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر اتخاذ جميع احتياطات السلامة والتعامل المناسبة لتقليل الصحة أو المخاطر البيئية. كشرط لاستلام المادة ، يوافق العميل على أن أي نشاط يتم إجراؤه مع منتج ATCC وأي ذرية أو تعديلات سيتم إجراؤها وفقًا لجميع القوانين واللوائح والإرشادات المعمول بها. يتم توفير هذا المنتج "كما هو" بدون أي تعهدات أو ضمانات من أي نوع باستثناء ما هو منصوص عليه صراحةً في هذه الوثيقة ولن تتحمل ATCC بأي حال من الأحوال مسؤولية شركة ATCC وأولياء الأمور والشركات التابعة لها والمديرين والمسؤولين والوكلاء والموظفين والمتنازل لهم والخلفاء والشركات التابعة لها بأي حال من الأحوال. الأضرار الخاصة أو العرضية أو التبعية من أي نوع فيما يتعلق أو الناشئة عن استخدام العميل للمنتج. في حين يتم بذل جهد معقول لضمان أصالة وموثوقية المواد المودعة ، فإن ATCC ليست مسؤولة عن الأضرار الناشئة عن الخطأ في تعريف هذه المواد أو تحريفها.


طرق تنقية البروتين: 4 طرق

يمكن تقسيم الطرق المستخدمة في تنقية البروتين تقريبًا إلى طرق تحليلية وتحضيرية.

التمييز ليس دقيقًا ، لكن العامل الحاسم هو كمية البروتين ، التي يمكن تنقيتها عمليًا بهذه الطريقة. تهدف الطرق التحليلية إلى اكتشاف وتحديد البروتين في الخليط ، بينما تهدف الطرق التحضيرية إلى إنتاج كميات كبيرة من البروتين لأغراض أخرى ، مثل البيولوجيا الهيكلية أو الاستخدام الصناعي. بشكل عام ، يمكن استخدام الطرق التحضيرية في التطبيقات التحليلية ، ولكن ليس العكس.

الطريقة الأولى: الاستخراج:

اعتمادًا على المصدر ، يجب إحضار البروتين إلى المحلول عن طريق تكسير الأنسجة أو الخلايا التي تحتوي عليه. هناك عدة طرق لتحقيق هذا التجميد المتكرر والذوبان ، الصوتنة ، التجانس بالضغط العالي أو النفاذية بواسطة المذيبات العضوية. تعتمد طريقة الاختيار على مدى هشاشة البروتين ومدى قوة الخلايا.

بعد عملية الاستخراج هذه ، سيكون البروتين القابل للذوبان في المذيب ، ويمكن فصله عن أغشية الخلايا ، والحمض النووي ، وما إلى ذلك عن طريق الطرد المركزي. تقوم عملية الاستخلاص أيضًا باستخراج البروتياز ، والذي سيبدأ في هضم البروتينات في المحلول. إذا كان البروتين حساسًا لتحلل البروتين ، فمن المستحسن عادةً المضي قدمًا بسرعة ، والحفاظ على المستخلص باردًا ، لإبطاء عملية تحلل البروتين.

الطريقة الثانية. الترسيب والذوبان التفاضلي:

في تنقية البروتين بالجملة ، تتمثل الخطوة الأولى الشائعة لعزل البروتينات في الترسيب بكبريتات الأمونيوم (NH4)2وبالتالي4. يتم إجراء ذلك عن طريق إضافة كميات متزايدة من كبريتات الأمونيوم وجمع الأجزاء المختلفة من البروتين المترسب. تتمثل إحدى مزايا هذه الطريقة في أنه يمكن إجراؤها بتكلفة منخفضة بأحجام كبيرة جدًا.

البروتينات الأولى التي يتم تنقيتها هي البروتينات القابلة للذوبان في الماء. تتطلب تنقية البروتينات الغشائية المتكاملة تمزيق غشاء الخلية من أجل عزل أي بروتين معين عن البروتينات الأخرى الموجودة في نفس الحيز الغشائي. في بعض الأحيان ، يمكن عزل جر غشاء معين أولاً ، مثل عزل الميتوكوندريا من الخلايا قبل تنقية البروتين الموجود في غشاء الميتوكوندريا.

يمكن استخدام منظف مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) لإذابة أغشية الخلايا والحفاظ على بروتينات الغشاء في المحلول أثناء التنقية ، ولكن نظرًا لأن SDS تسبب تمسخًا ، يمكن استخدام المنظفات الأكثر اعتدالًا مثل Triton X-100 أو CHAPS للاحتفاظ بالبروتين & # 8217s التشكل الأصلي أثناء التنقية.

الطريقة رقم 3. تنبيذ فائق:

الطرد المركزي هو عملية تستخدم قوة الطرد المركزي لفصل خليط من الجسيمات ذات الكتل المتفاوتة أو الكثافات المعلقة في سائل. عندما يتم تدوير وعاء (عادة أنبوب أو زجاجة) يحتوي على خليط من البروتينات أو الجسيمات الأخرى ، مثل الخلايا البكتيرية ، بسرعات عالية ، ينتج عن الزخم الزاوي قوة خارجية لكل جسيم تتناسب مع كتلته.

ميل جسيم معين للتحرك خلال السائل بسبب هذه القوة يقابله المقاومة التي يمارسها السائل على الجسيم. التأثير الصافي للعينة في جهاز الطرد المركزي & # 8220 spinning & # 8221 هو أن الجسيمات الضخمة والصغيرة والكثيفة تتحرك إلى الخارج أسرع من الجسيمات أو الجسيمات الأقل كتلة مع وجود المزيد من & # 8220drag & # 8221 في السائل.

عندما تكون معلقات الجسيمات & # 8220 spun & # 8221 في جهاز طرد مركزي ، قد تتشكل & # 8220 pellet & # 8221 في الجزء السفلي من الوعاء المخصب لمعظم الجسيمات الضخمة ذات السحب المنخفض في السائل. تسمى الجسيمات المتبقية غير المضغوطة المتبقية في الغالب في السائل بـ & # 8220supernatant & # 8221 ويمكن إزالتها من الوعاء لفصل المادة الطافية عن الحبيبات.

يتم تحديد معدل الطرد المركزي من خلال التسارع الزاوي المطبق على العينة ، ويقاس عادةً بالمقارنة مع g. إذا تم الطرد المركزي للعينات لفترة كافية ، فستصل الجسيمات الموجودة في الوعاء إلى التوازن حيث تتراكم الجزيئات على وجه التحديد في نقطة في الوعاء حيث تتوازن كثافة طفوها مع قوة الطرد المركزي. مثل هذا & # 8220equilibrium & # 8221 الطرد المركزي يمكن أن يسمح بتنقية واسعة النطاق لجسيم معين.

الطرد المركزي التدرج السكروز:

يتم إنشاء تدرج تركيز خطي للسكر (عادةً سكروز جلسرين ، أو بيركول) في أنبوب بحيث يكون أعلى تركيز في الأسفل والأدنى في الأعلى. ثم يتم وضع عينة من البروتين فوق التدرج اللوني ونسجها بسرعات عالية في جهاز طرد مركزي فائق. هذا يتسبب في هجرة الجزيئات الثقيلة نحو قاع الأنبوب بشكل أسرع من المواد الأخف.

أثناء الطرد المركزي في غياب السكروز ، حيث تتحرك الجسيمات أبعد وأبعد من مركز الدوران ، فإنها تواجه المزيد والمزيد من قوة الطرد المركزي (كلما تحركت ، زادت سرعة تحركها). تكمن المشكلة في ذلك في أن نطاق الفصل المفيد داخل السفينة يقتصر على نافذة صغيرة يمكن ملاحظتها.

إن تدوير العينة مرتين لا يعني أن الجسيم المعني سيذهب إلى الضعف في الواقع ، بل سيذهب أبعد بكثير. ومع ذلك ، عندما تتحرك البروتينات عبر تدرج سكروز ، فإنها تواجه سائلًا ذا كثافة ولزوجة متزايدة.

إن التدرج اللوني للسكروز المصمم بشكل صحيح سوف يقاوم قوة الطرد المركزي المتزايدة ، لذلك تتحرك الجسيمات بشكل متناسب مع الوقت الذي كانت فيه في مجال الطرد المركزي. يشار إلى العينات المفصولة بهذه التدرجات باسم & # 8220rate zonal & # 8221 Centrifugations. بعد فصل البروتين / الجزيئات ، يتم بعد ذلك تجزئة التدرج وجمعه.

الطريقة رقم 4. طرق الكروماتوغرافيا:

عادة ما يحتوي بروتوكول تنقية البروتين على خطوة كروماتوغرافية واحدة أو أكثر. يتمثل الإجراء الأساسي في الفصل الكروماتوغرافي في تدفق المحلول المحتوي على البروتين عبر عمود معبأ بمواد مختلفة. تتفاعل البروتينات المختلفة بشكل مختلف مع مادة العمود ، وبالتالي يمكن فصلها بالوقت اللازم لتمرير العمود ، أو الشروط المطلوبة لاستخراج البروتين من العمود. عادة ما يتم الكشف عن البروتينات لأنها تخرج من العمود بامتصاصها عند 280 نانومتر.

توجد العديد من الطرق الكروماتوجرافية المختلفة:

1. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم:

Chromatography can be used to separate protein in solution or denaturing conditions by using porous gels. تُعرف هذه التقنية باسم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. المبدأ هو أن الجزيئات الأصغر يجب أن تعبر حجمًا أكبر في مصفوفة مسامية. Consequentially, proteins of a certain range in size will require a variable volume of eluant (solvent) before being collected at the other end of the column of gel.

In the context of protein purification, the eluant is usually pooled in different test tubes. يتم التخلص من جميع أنابيب الاختبار التي لا تحتوي على أي أثر للبروتين المطلوب تنقيته. وهكذا يتكون المحلول المتبقي من البروتين المطلوب تنقيته وأي بروتينات أخرى مماثلة في الحجم.

2. اللوني التبادل الأيوني:

يفصل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني المركبات حسب طبيعة ودرجة شحنتها الأيونية. يتم اختيار العمود الذي سيتم استخدامه وفقًا لنوعه وقوة شحنته. راتنجات تبادل الأنيون لها شحنة موجبة وتستخدم للاحتفاظ وفصل أرطال كومباوند سالبة الشحنة ، في حين أن راتنجات التبادل الكاتيوني لها شحنة سالبة وتستخدم لفصل الجزيئات موجبة الشحنة.

قبل أن يبدأ الفصل ، يتم ضخ المخزن المؤقت عبر العمود لموازنة الأيونات المشحونة المتعارضة. عند حقن العينة ، ستتبادل الجزيئات المذابة مع أيونات العازلة حيث يتنافس كل منها على مواقع الربط على الراتنج. يعتمد طول فترة الاحتفاظ لكل مادة مذابة على قوة شحنتها.

سيتم التخلص من المركبات ذات الشحنة الضعيفة أولاً ، تليها المركبات ذات الشحنات الأقوى على التوالي. نظرًا لطبيعة آلية الفصل ، يلعب كل من الأس الهيدروجيني ونوع المخزن المؤقت وتركيز المخزن المؤقت ودرجة الحرارة أدوارًا مهمة في التحكم في الفصل. يعتبر كروماتوغرافيا التبادل الأيوني أداة قوية جدًا لاستخدامها في تنقية البروتين وغالبًا ما تستخدم في عمليات الفصل التحليلية والتحضيرية.

3. تقارب اللوني:

كروماتوغرافيا التقارب هي تقنية فصل تعتمد على التشكل الجزيئي ، والتي تستخدم في كثير من الأحيان راتنجات خاصة بالتطبيق. تحتوي هذه الراتنجات على روابط مثبتة على أسطحها خاصة بالمركبات المراد فصلها. في أغلب الأحيان ، تعمل هذه الروابط بطريقة مشابهة لتفاعلات الجسم المضاد والمستضد. يتناسب هذا & # 8220lock والمفتاح & # 8221 بين ligand ومركبته المستهدفة مما يجعله محددًا للغاية ، ويؤدي في كثير من الأحيان إلى توليد ذروة واحدة ، بينما لا يتم الاحتفاظ بكل شيء آخر في العينة.

العديد من بروتينات الغشاء عبارة عن بروتينات سكرية ويمكن تنقيتها عن طريق كروماتوجرافيا تقارب الليكتين. يمكن السماح للبروتينات المذابة في المنظف بالارتباط براتنج كروماتوغرافيا تم تعديله ليكون له ليكتين متصل تساهميًا.

يتم التخلص من البروتينات التي لا ترتبط بالكتين ، ومن ثم يمكن استخلاص البروتينات السكرية المرتبطة على وجه التحديد عن طريق إضافة تركيز عالٍ من السكر الذي يتنافس مع البروتينات السكرية المرتبطة في موقع ربط الليكتين. تحتوي بعض الليكتينات على ارتباط عالٍ بالسكريات قليلة السكاريد من البروتينات السكرية التي يصعب منافستها مع السكريات ، ويجب إطلاق البروتينات السكرية المرتبطة عن طريق تغيير طبيعة الليكتين.

4. تجليد المعادن:

تتضمن التقنية الشائعة هندسة تسلسل من 6 إلى 8 هيستيدينات في الطرف C للبروتين. يرتبط متعدد الهيستيدين بشدة بأيونات المعادن ثنائية التكافؤ مثل النيكل والكوبالت. يمكن أن يمر البروتين عبر عمود يحتوي على أيونات النيكل المجمدة ، والتي تربط علامة polyhistidine. تمر جميع البروتينات غير المميزة عبر العمود.

يمكن استخلاص البروتين باستخدام إيميدازول ، والذي يتنافس مع علامة البولي هيستيدين للارتباط بالعمود ، أو عن طريق تقليل الأس الهيدروجيني (عادةً إلى 4.5) ، مما يقلل من تقارب العلامة للراتنج. بينما يستخدم هذا الإجراء عمومًا لتنقية البروتينات المؤتلفة بعلامة تقارب هندسية (مثل علامة 6xHis أو علامة HAT Clontech & # 8217s) ، يمكن أيضًا استخدامها للبروتينات الطبيعية ذات التقارب المتأصل في الكاتيونات ثنائية التكافؤ.

5. كروماتوغرافيا الانجذاب المناعي:

يستخدم كروماتوغرافيا الانجذاب المناعي الارتباط المحدد لجسم مضاد بالبروتين المستهدف لتنقية البروتين بشكل انتقائي. يتضمن الإجراء تثبيت الجسم المضاد في مادة العمود ، والتي تقوم بعد ذلك بربط البروتين بشكل انتقائي ، بينما يتدفق كل شيء آخر من خلاله. يمكن التخلص من البروتين Ix عن طريق تغيير درجة الحموضة أو الملوحة. نظرًا لأن هذه الطريقة لا تنطوي على هندسة في علامة ، فيمكن استخدامها للبروتينات من المصادر الطبيعية.

6. HPLC:

اللوني السائل عالي الأداء أو اللوني السائل عالي الضغط هو شكل من أشكال اللوني يطبق ضغطًا عاليًا لدفع المواد المذابة عبر العمود بشكل أسرع. هذا يعني أن الانتشار محدود والدقة محسنة. الشكل الأكثر شيوعًا هو & # 8220 انعكاس الطور & # 8221 HPLC ، حيث تكون مادة العمود كارهة للماء.

يتم التخلص من البروتينات من خلال تدرج كميات متزايدة من مذيب عضوي ، مثل الأسيتونتريل. تتم إزالة البروتينات حسب قدرتها على مقاومة الماء. بعد التنقية بواسطة HPLC ، يكون البروتين في محلول يحتوي فقط على مركبات متطايرة ، ويمكن بسهولة تجفيفه بالتجميد. ينتج عن تنقية HPLC في كثير من الأحيان تمسخ البروتينات المنقاة وبالتالي لا ينطبق على البروتينات التي لا يتم إعادة طيها تلقائيًا.


Growth Curve of Bacteria: 4 Phases

After inoculation into the sterile nutrient medium, the bacterium first under­goes a period of acclimatisation. At that time, necessary enzymes and intermediate metabolites are synthesised, thereby bacte­rium reaches a critical stage before multi­plication, multiplication takes place at this stage.

The duration of lag phase depends on the type of bacteria, quality of culture medium, size of inoculum and several environmental factors such as CO2, temperature, pH, etc. The average time of lag phase is 2 hours, although it varies from species to species (1-4 hours).

2. Log Phase or Exponential Phase:

In this phase, the bacteria undergo cell division and their population (number) increase exponentially at a logarithmic rate. The number of viable count, when plotted against time, gives a straight line of inclined fashion. The average time of log phase is 8 hours, though it varies in different species.

3. Stationary Phase:

In this phase, the growth i.e., cell division, almost ceases due to exhaustion of nutrients and also the accu­mulation of toxic products. At this stage the cell death starts at a slow rate and is com­pensated by the formation of new cell through cell division.

The total cell number increases at a slow rate, but the viable count remains almost constant. The duration of this phase is variable which ranges from few days to few hours. Secondary metabolites like antibiotics, toxins etc. are produced in this phase.

4. Decline Phase:

In the phase of decline, the total number of cells remains constant, but the number of viable cells gradually decreases due to exhaustion of nutrients and also the accumulation of toxic products. In some cases a few- cells remain viable for long time, even after death of most of the cells. These viable cells probably grow by utilising nutrients released from dead cells.

The cells attain maximum size at the end of lag phase and become smaller in log phase (exponential phase). In spore forming species, the sporulation occurs at the end of log phase (exponential phase) or in the early part of sta­tionary phase.


Nanoluciferase Reporter Mycobacteriophage for Sensitive and Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis Drug Susceptibility

Phenotypic testing for drug susceptibility of السل الفطري is critical to basic research and managing the evolving problem of antimicrobial resistance in tuberculosis management, but it remains a specialized technique to which access is severely limited. Here, we report on the development and validation of an improved phage-mediated detection system for مرض السل We incorporated a nanoluciferase (Nluc) reporter gene cassette into the TM4 mycobacteriophage genome to create phage TM4-nluc. We assessed the performance of this reporter phage in the context of cellular limit of detection and drug susceptibility testing using multiple biosafety level 2 drug-sensitive and -resistant auxotrophs as well as virulent مرض السل سلالات. For both limit of detection and drug susceptibility testing, we developed a standardized method consisting of a 96-hour cell preculture followed by a 72-hour experimental window for مرض السل detection with or without antibiotic exposure. The cellular limit of detection of مرض السل in a 96-well plate batch culture was ≤10 2 CFU. Consistent with other phenotypic methods for drug susceptibility testing, we found TM4-nluc to be compatible with antibiotics representing multiple classes and mechanisms of action, including inhibition of core central dogma functions, cell wall homeostasis, metabolic inhibitors, compounds currently in clinical trials (SQ109 and Q203), and susceptibility testing for bedaquiline, pretomanid, and linezolid (components of the BPaL regimen for the treatment of multi- and extensively drug-resistant tuberculosis). Using the same method, we accurately identified rifampin-resistant and multidrug-resistant مرض السل سلالات.IMPORTANCE السل الفطري, the causative agent of tuberculosis disease, remains a public health crisis on a global scale, and development of new interventions and identification of drug resistance are pillars in the World Health Organization End TB Strategy. Leveraging the tractability of the TM4 mycobacteriophage and the sensitivity of the nanoluciferase reporter enzyme, the present work describes an evolution of phage-mediated detection and drug susceptibility testing of مرض السل, adding a valuable tool in drug discovery and basic biology research. With additional validation, this system may play a role as a quantitative phenotypic reference method and complement to genotypic methods for diagnosis and antibiotic susceptibility testing.

الكلمات الدالة: Mycobacterium tuberculosis bacteriophages drug screening drug susceptibility testing nanoluciferase phage.

Copyright © 2020 Jain et al.

الأرقام

Schematic overview of phage reporter…

Schematic overview of phage reporter construct and method. TM4-nluc derives from modifying the…

Phage-mediated M. tuberculosis limit of…

Phage-mediated M. tuberculosis limit of detection is ≤10 2 CFU, and signal improves…

Seventy-two-hour drug susceptibility testing of…

Seventy-two-hour drug susceptibility testing of auxotroph and virulent M. tuberculosis strains with a…

Using defined drug-sensitive and -resistant…

Using defined drug-sensitive and -resistant M. tuberculosis auxotrophs TM4-nluc enables 72-hour resistance testing…


Cell culture-based production and in vivo characterization of purely clonal defective interfering influenza virus particles

خلفية: Infections with influenza A virus (IAV) cause high morbidity and mortality in humans. Additional to vaccination, antiviral drugs are a treatment option. Besides FDA-approved drugs such as oseltamivir or zanamivir, virus-derived defective interfering (DI) particles (DIPs) are considered promising new agents. IAV DIPs typically contain a large internal deletion in one of their eight genomic viral RNA (vRNA) segments. Consequently, DIPs miss the genetic information necessary for replication and can usually only propagate by co-infection with infectious standard virus (STV), compensating for their defect. In such a co-infection scenario, DIPs interfere with and suppress STV replication, which constitutes their antiviral potential.

نتائج: In the present study, we generated a genetically engineered MDCK suspension cell line for production of a purely clonal DIP preparation that has a large deletion in its segment 1 (DI244) and is not contaminated with infectious STV as egg-derived material. First, the impact of the multiplicity of DIP (MODIP) per cell on DI244 yield was investigated in batch cultivations in shake flasks. Here, the highest interfering efficacy was observed for material produced at a MODIP of 1E-2 using an in vitro interference assay. Results of RT-PCR suggested that DI244 material produced was hardly contaminated with other defective particles. Next, the process was successfully transferred to a stirred tank bioreactor (500 mL working volume) with a yield of 6.0E+8 PFU/mL determined in genetically modified adherent MDCK cells. The produced material was purified and concentrated about 40-fold by membrane-based steric exclusion chromatography (SXC). The DI244 yield was 92.3% with a host cell DNA clearance of 97.1% (99.95% with nuclease digestion prior to SXC) and a total protein reduction of 97.2%. Finally, the DIP material was tested in animal experiments in D2(B6).A2G-Mx1 r/r mice. Mice infected with a lethal dose of IAV and treated with DIP material showed a reduced body weight loss and all animals survived.

استنتاج: In summary, experiments not only demonstrated that purely clonal influenza virus DIP preparations can be obtained with high titers from animal cell cultures but confirmed the potential of cell culture-derived DIPs as an antiviral agent.

الكلمات الدالة: Animal experiments Antiviral Cell culture-based production DI244 Defective interfering particles Genetically engineered MDCK cells Influenza A virus Scale up Steric exclusion chromatography.


شاهد الفيديو: المحاضرة السادسة Lec:6 البكتريا المرضية Pathogenic bacteria. الجزء الثالث (شهر نوفمبر 2022).