معلومة

ما هو الفرق بين Endoproteinase Lys-C و Lysyl endopeptidase؟

ما هو الفرق بين Endoproteinase Lys-C و Lysyl endopeptidase؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هو الفرق بين Endoproteinase Lys-C و Lysyl endopeptidase؟

في النص الذي أترجمه حول رسم خرائط الببتيد ، تم ذكر "ليسين بروتياز" (بالروسية: лизиновая протеаза). قد يكون من الخطأ ترجمة كلمة بكلمة على أنها "ليسين بروتياز". يجب أن يكون هناك خطأ بسيط في النص الأصلي. هذا "ليسين بروتياز" مذكور هناك بسبب استخدامه في التحلل المائي للبروتين.

أعتقد أن الترجمة الصحيحة قد تكون أيضًا endoproteinase Lys-C أو ليسيل إندوبيبتيداز.

لقد وجدت أن endoproteinase Lys-C يستخدم في رسم خرائط الببتيد. هل هي مرادفة وقابلة للتبادل مع lysyl endopeptidase ، أم أنها تختلف في وظيفتها؟ هل يتم استخدام Endoproteinase Lys-C في كثير من الأحيان كعامل تحلل مائي في رسم خرائط الببتيد؟

ربما يكون الاختلاف هو أن البروتين الداخلي Lys-C ينشق "على الجانب C الطرفي لبقايا الليسين" ، بينما ينشق lysyl endopeptidase على كلا الجانبين؟


يسمح ذبابة SILAC بتقدير كمية البروتين بدقة في فيفو *

يتم استخدام وسم النظائر المستقرة بواسطة الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) على نطاق واسع لتحديد وفرة البروتين في خلايا زراعة الأنسجة. حتى الآن ، كان الكائن الوحيد متعدد الخلايا المصنف بالكامل على مستوى الأحماض الأمينية هو فأر المختبر. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة سوداء البطن هو أحد أكثر نماذج الحيوانات الصغيرة استخدامًا في علم الأحياء. هنا ، نوضح أن تغذية الذباب بالخميرة التي تحمل علامة SILAC تؤدي إلى وضع العلامات شبه الكامل في الجيل الأول من الأبناء. استخدمنا هذه & # x0201cSILAC flies & # x0201d للتحقيق في إزدواج الشكل الجنسي لوفرة البروتين في D. melanogaster. كشفت المقارنة البروتينية الكمية للذباب البالغ من الذكور والإناث عن عمليات بيولوجية مميزة خاصة بكل جنس. باستخدام أ تيودور المتحولة المعيبة لتوليد الخلايا الجرثومية سمحت لنا بالتفريق بين التعبير البروتيني الخاص بالجنس في خط الجراثيم والأنسجة الجسدية. حددنا العديد من البروتينات ذات التحيز المعروف في التعبير الخاص بالجنس. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد العديد من البروتينات الجديدة التي لها دور محتمل في إزدواج الشكل الجنسي. بشكل جماعي ، تُظهر بياناتنا أنه يمكن استخدام ذبابة SILAC لتحديد كمية البروتين بدقة في الجسم الحي. النهج بسيط وسريع وفعال من حيث التكلفة ، مما يجعل SILAC يطير نظامًا نموذجيًا جذابًا لمجال ناشئ في الجسم الحي البروتينات الكمية.

ظهرت البروتينات الكمية القائمة على قياس الطيف الكتلي كنهج ناجح للغاية لدراسة العمليات البيولوجية في الصحة والمرض (1 & # x020133). اقتصرت معظم الدراسات حتى الآن على في المختبر أنظمة مثل نماذج زراعة الخلايا. على الرغم من أن هذه النماذج مفيدة للغاية ، إلا أنها لا يمكن أن تعكس بشكل مناسب الآليات التنظيمية ذات الصلة لحقيقيات النوى متعددة الخلايا في الجسم الحي. هذا مهم بشكل خاص للعمليات المعقدة التي تنطوي على تفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة مثل التمايز والتطوير (4).

يتم قياس التغيرات النسبية في وفرة البروتين بدقة أكبر من خلال مقارنة الشكل الطبيعي للببتيد مع نظيره الثابت المسمى بالنظائر. تمكّن عدة طرق مختلفة من وضع العلامات على النظائر المستقرة للببتيدات إما عن طريق التفاعلات الكيميائية أو التضمين الأيضي للملصق (5 ، 6). تتميز العلامات الأيضية بالعديد من المزايا مثل كفاءة وضع العلامات العالية والدقة العالية في جوهرها. على سبيل المثال ، يمكن دمج العينات ذات العلامات الأيضية قبل خطوات المعالجة الإضافية بحيث لا يتأثر تقدير كمية البروتين بالاختلافات في تحضير العينة. كان رودولف شوينهايمر هو الرائد في عملية تصنيف الكائنات الحية باستخدام أدوات تتبع النظائر المستقرة قبل 75 عامًا (7 ، 8). منذ ذلك الحين ، تم تصنيف العديد من الكائنات الحية النموذجية التي تتراوح من بدائيات النوى إلى الثدييات بطريقة التمثيل الغذائي (للحصول على مراجعة ممتازة ، انظر المرجع 9). على سبيل المثال، أنواع معينة انيقة و ذبابة الفاكهة سوداء البطن تم تصنيفها بنجاح بـ 15 N (10) ، واستخدمت 15 ذبابة تحمل علامة N مؤخرًا لدراسة الانتقال من الأم إلى اللاقحة (11) وبروتينات السائل المنوي (sfps) 1 المنقولة عند التزاوج (12). تم استخدام 15 N أيضًا لتسمية الفئران بأكملها ، خاصةً بالنسبة لبروتينات الدماغ الكمية (13 ، 14). على الرغم من فائدتها ، إلا أن تسمية 15 N لها عيوب عديدة. نظرًا لأن معظم الببتيدات تحتوي على العشرات من ذرات النيتروجين ، فإن وضع العلامات باستخدام 15 نيوتن عالي التخصيب لا يزال ينتج عنه وضع علامات جزئية فقط على الببتيد وبالتالي مجموعات النظائر المعقدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التحول الشامل بين المسمى (بمعنى آخر. ثقيل) وغير مصنف (بمعنى آخر. يعتمد الضوء) على أشكال الببتيد على عدد ذرات النيتروجين ، وبالتالي يختلف اعتمادًا على تسلسل الببتيد. يؤدي هذا إلى زيادة عدد الكتل المرشحة التي يجب أخذها في الاعتبار ، وبالتالي يعقد تحديد الببتيد بواسطة خوارزميات البحث. تؤدي كلتا المشكلتين إلى معدلات تعريف أصغر وتقدير أقل دقة يمكن التغلب عليه جزئيًا عن طريق التصحيح الحسابي (15 ، 16).

يعد وضع العلامات على النظائر المستقرة بواسطة الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) نهجًا آخر لوضع العلامات الأيضية مع العديد من المزايا الفريدة (17): نظرًا لأنه يتم تقديم الملصق على مستوى الأحماض الأمينية ، يمكن بسهولة تفسير أطياف الكتلة ، ويمكن قياس كمية الببتيدات بدرجة عالية الاحكام. جعلت هذه الميزات من SILAC نهجًا شائعًا جدًا للبروتيوميات الكمية والوظيفية القائمة على ثقافة الخلية (18). كعيب محتمل ، يُعتقد عمومًا أن SILAC يقتصر على في المختبر تجارب زراعة الخلايا. تم إجراء تجارب SILAC الوحيدة في نموذج الطيران باستخدام خطوط الخلايا المزروعة في المختبر (19 ، 20). ومع ذلك ، في عام 2005 ، Hayter وآخرون. أظهر (21) أنه يمكن تصنيف الدجاج جزئيًا على مستوى الأحماض الأمينية عن طريق إطعامهم بنظام غذائي يحتوي على حمض الفالين المستقر المسمى بالنظائر. بعد ثلاث سنوات ، Kr & # x000fcger وآخرون. (22) حقق بشكل أساسي وضع العلامات الكاملة على فأر المختبر. حتى الآن ، كان هذا ما يسمى & # x0201cSILAC mouse & # x0201d هو الكائن الوحيد متعدد الخلايا الذي تم تسميته بالكامل بنهج SILAC ، وقد تم تحقيق وضع العلامات الجزئي مؤخرًا في نيوت (21 ، 23).

هنا نقدم لكم ذبابة الفاكهة D. melanogaster في حديقة حيوانات SILAC. نشير إلى هذه الحيوانات باسم ذباب SILAC لأنه يتم الحصول عليها عن طريق تغذية الذباب على الخميرة التي تحمل علامة SILAC. D. melanogaster هي واحدة من أفضل أنواع الكائنات الحية المميزة وقد تم استخدامها لمعالجة العديد من الأسئلة الأساسية في علم الأحياء (24). حتى الآن ، معظم الدراسات في D. melanogaster ركزوا على الجوانب الجينية (25). ومع ذلك ، فإن البروتينات هي العناصر الفاعلة الرئيسية في معظم العمليات البيولوجية. لذلك من المستحسن للغاية الحصول على معلومات كمية على مستوى البروتين في D. melanogaster. لقد أوضحنا في هذه الدراسة أن رفع يرقات الذباب على نظام غذائي من خلايا الخميرة الثقيلة التي تحمل علامات اللايسين يؤدي إلى وضع علامات ثقيلة كاملة تقريبًا في أول طفل (F1) توليد. علاوة على ذلك ، نظهر أن ذبابة SILAC تتيح القياس الكمي على مستوى البروتين بدقة أعلى من الطريقة الخالية من الملصقات. في سلسلة من تجارب إثبات المبدأ ، استخدمنا ذبابة SILAC للتحقيق في التعبير الجنسي عن البروتين ثنائي الشكل في D. melanogasterوبالتالي توفير أول مقارنة منهجية بين ذكور وإناث الذباب على مستوى البروتين.


2. المواد والأساليب

2.1 المواد

ن-بنزويل- دل -ليسين-ص-نيتروانيليد (Bz-Lys-ص NA) من Wako Pure Chemical Industries ، أوساكا ، اليابان. ن-توسيل- l -lysine-methyl ester (Tos-Lys-OMe) ، ن-بنزويل- الارجينين-ص-نيتروانيليد (Bz-Arg-ص غير متوفر) ، ن-السكسينيل- ألانين-ص- نيتروانيليد (Suc-Ala-ص غير متوفر) ، ن-بنزويل- ل- التيروزين-ص-نيتروانيليد (Bz-Tyr-ص NA) ، وجلوكاجون (بشري) ، وبروتين أميلويد بيتا (بشري ، من 1 إلى 40) من معهد الببتيد ، أوساكا ، اليابان. ن-بنزويل- l -lysine-methyl ester (Bz-Lys-OMe) ، ن-الاسيتيل- ل -ليسين-ص- نيتروانيليد (Ac-Lys-ص NA) ، ارجينين-ص-نيتروانيليد (أرج-ص غير متوفر) ، ن-الاسيتيل- l -leucine-ص- نيتروانيليد (Ac-Leu-ص غير متوفر) و ن-اسيتيل- ل- فينيلالانين-ص- نيتروانيليد (Ac-Phe-ص NA) من Bachem AG ، سويسرا. ن-بنزويل- ل -ورنيثين-ص-نيتروانيليد (Bz-Orn-ص NA) والثالث-butoxycarbonyl- l -histidine-ص-نيتروانيليد (بوك-هيس-ص NA) من Vega Biochemicals ، AZ ، الولايات المتحدة الأمريكية. ل-ليسين-ص-نيتروانيليد (ليس-ص NA) من شركة Merck KGa ، دارمشتات ، ألمانيا. سلسلة الأنسولين B المؤكسدة (بقري ، حمض حر) كانت من شركة سيجما الدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية. ن-توسيل- ليسين كلورو ميثيل كيتون (Tos-LysCH2Cl) و ن-tosyl- l -phenylalanine chloromethyl ketone (Tos-PheCH2Cl) من Boehringer Mannheim ، مانهايم ، ألمانيا. ن-توسيل- أرجينين كلوروميثيل كيتون (Tos-ArgCH2تم توفير Cl) من قبل Shionogi Research Laboratory ، أوساكا ، اليابان. مثبط التربسين من فول الصويا (STI) كان من شركة ورثينجتون للكيماويات الحيوية ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية. كان CM-Toyopearl 650M من شركة Tosoh ، طوكيو ، اليابان. كان DEAE-cellulose SH من شركة Nakarai tesque Inc. ، كيوتو ، اليابان. كانت AH-Sepharose 4B ومجموعة معايرة الرحلان الكهربائي لتحديد الكتلة الجزيئية من Amersham Pharmacia Biotech AB ، أوبسالا ، السويد. تم تحضير STI-Sepharose 4B بطريقة Cuatrecases et al. [21]. المواد الكيميائية الأخرى المستخدمة كانت من درجة الكاشف.

2.2 فحص سلالة إنتاج الليسيل إندوبيبتيداز

لعزل البكتيريا التي تنتج إندوبيبتيداز ليسيل ، تم نشر عينات التربة على 2٪ ألواح أجار (الرقم الهيدروجيني 7.2) تحتوي على 1٪ جلوتين القمح المهضوم بالببسين (Glurich ، شركة Chiba Flour Milling Co. ، تشيبا ، اليابان) كمصدر وحيد للكربون والطاقة. بعد الحضانة لمدة 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية ، تم عزل المستعمرات التي شكلت مناطق صافية ثم تمت زراعة كل كائن حي في وسط A يتكون من 0.5٪ كازين من الحليب (Nakarai tesque) ، 1٪ سكروز ، 1٪ مستخلص لحم بقري ( ديفكو) ، 0.01٪ KH2ص4، 0.01٪ ك2HPO4، و 0.01٪ MgSO4 عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع اهتزاز متبادل. تم طرد مرق المزرعة من أجل إزالة الخلايا وتم اختبار المواد الطافية من أجل Bz-Lys-ص نشاط التحلل المائي NA. أظهرت بكتيريا من تربة المزرعة التجريبية في جامعتنا أعلى نشاط حال للوسط وتم اختيارها كمنتج ليسيل إندوبيبتيداز. تم تحديد هذه السلالة على أنها ليسوباكتر ص. من الشخصيات الفسيولوجية وتسلسل 16S rDNA. نحن نصنف هذه السلالة على أنها ليسوباكتر ص. IB-9374 ، المحفوظ في مستودع براءات الاختراع للكائنات الدقيقة ، المعهد الوطني للعلوم البيولوجية والتكنولوجيا البشرية ، تسوكوبا ، اليابان ، تحت رقم الانضمام FERM P-16928.

2.3 السلالات البكتيرية والبلازميدات وظروف الاستزراع

ليسوباكتر ص. IB-9374 ، A. lyticus M497-1 و إنزيمات L. تمت زراعة خلايا ATCC 29487 بشكل هوائي على وسط A عند 30 درجة مئوية. الإشريكية القولونية المستخدمة في هذه الدراسة كانت سلالة DH5αMCR [F - مكراΔ (السيد-hsdRMS-mcrBC) (φ80 لاكزΔM15) Δ (لاكزيا-أرجف)U169 deoR recA 1 النهاية 44 - ثي-1 جيرا 96 ريلا 1] وسلالة JM109 [recA 1 النهاية 1 جيرا 96 thi hsdR 17 سوب 44 ريلا 1 λ - Δ (lac-proAB) F'(traD 36 proAB lacI ف لاكزΔM15)] [22]. بكتريا قولونية نمت سلالات هوائية على مرق لوريا-بيرتاني [23] عند 37 درجة مئوية. تم استخدام المضادات الحيوية بالتركيزات التالية: الأمبيسيلين (Ap) ، 50 ميكروغرام مل -1 والنيومايسين (نانومتر) ، 25 ميكروغرام مل. ناقل Cosmid Lorist 6 (تم الحصول على Nm r من Nippon Gene ، طوكيو ، اليابان) [24] ، ناقلات البلازميد pUC118 (Ap r) [25] ، و pGEM T-vector (تم الحصول على Ap r من شركة Promega ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية ) لبناء مكتبة DNA الجينومية لـ ليسوباكتر ص. IB-9374 ، للاستنساخ الفرعي ، وبناء مسبار خاص بالجينات ، على التوالي.

2.4 فحوصات الإنزيم والبروتين

تم قياس أنشطة التحلل من مادة lysyl endopeptidases باستخدام Bz-Lys-ص غير متوفر. يحتوي خليط الفحص (1.45 مل) على 180 ملي مولار من محلول Tris – HCl (pH 9.2) و 0.25 ملي مولار Bz-Lys-ص تم تحضين NA عند 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بدأ التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من محلول الإنزيم المخفف بشكل مناسب. بعد الحضانة لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية ، تم إنهاء التفاعل بإضافة 0.25 مل من 45٪ (حجم / حجم) حمض أسيتيك ، وتم قياس الكثافة الضوئية عند 405 نانومتر بمعامل انقراض قدره 9620 م -1 سم -1 ل ص-نيتروانيلين [26]. تم قياس نشاط الأستروليت باستخدام Tos-Lys-OMe. بدأ التفاعل بإضافة 0.1 مل من محلول الإنزيم إلى 2.9 مل من محلول يحتوي على 41 ملي مولار من محلول Tris-HCl (pH 8.0) و 0.35 ملي مولار Tos-Lys-OMe. تم تقدير المعدل الأولي عن طريق قياس الكثافة الضوئية عند 247 نانومتر عند 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم استخدام اختلاف في معامل الانقراض 960 م -1 سم -1 [27]. تم قياس نشاط الكازين عند 40 درجة مئوية مع نسبة 0.7٪ من الكازين المشوه في 50 ملي مولار من محلول Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 9.0) [28]. تم تعريف وحدة واحدة من نشاط التحلل على أنها كمية الإنزيم التي تحلل 1 ميكرولتر الركيزة في دقيقة واحدة عند 30 درجة مئوية. لتحديد الثوابت الحركية ، تم إجراء التحلل المائي لركائز الأنيليد والإستر بواسطة إجراءات الفحص القياسية الموضحة أعلاه. قيم كم و كقط تم حسابها من مخططات Lineweaver-Burk مع خمسة أو ستة تركيزات ركيزة. لحساب كقط، الكتلة الجزيئية لـ Ls-LEP ، 28 كيلو دالتون ، تم استخدامها. تم تقدير تركيز البروتين بالكثافة الضوئية عند 280 نانومتر في مراحل مختلفة من عملية التنقية. في تحضير الإنزيم المنقى ، تم تقدير تركيز البروتين بالطيف الضوئي عند 280 نانومتر بافتراض أن معامل الانقراض المحدد هو ه1 سم 1% = 18.77[ 8].

2.5 تنقية Ls-LEP

ليسوباكتر ص. نمت الخلايا بشكل هوائي على الوسط A عند 30 درجة مئوية لمدة 225 ساعة. تمت إزالة الخلايا بالطرد المركزي عند 31000 ×ز لمدة 10 دقائق ، وتم استخدام المادة الطافية (9.8 لتر) كمادة أولية لتنقية الإنزيم. تمت جميع عمليات إجراء التنقية عند 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك. تمت تنقية Ls-LEP بالطريقة الموصوفة سابقًا [13] فيما عدا أنه تم استخدام تجزئة كبريتات الأمونيوم وكروماتوجرافيا التقارب STI-Sepharose 4B حديثًا بدلاً من تجزئة الأسيتون والتركيز الكهروضوئي ، على التوالي. تم إحضار المادة الطافية إلى 50٪ تشبع بكبريتات الأمونيوم وبعد التقليب عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، تم طرد المعلق عند 31000 ×ز لمدة 10 دقائق. تمت معالجة المادة الطافية بكبريتات أمونيوم إضافية حتى يتحقق التشبع بنسبة 90٪. تمت إزالة الراسب الناتج عن طريق الطرد المركزي وتم إذابته في 1 لتر من 10 ملي مولار من Tris – HCl ، ودرجة الحموضة 7.0 ، ودالته مقابل نفس المخزن المؤقت. تم خلط المحلول المُحلل مع CM-Toyopearl 650M (530 جم) وتم ترشيح المعلق من خلال مرشح زجاجي (26G-3). تم تركيز المادة المرشحة بغشاء فائق الترشيح (Amicon PM-10) وتم تحليلها مقابل 10 ملي مولار من Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0. تم خلط المحلول مع DEAE-cellulose SH (475 جم) وتم ترشيح المعلق من خلال مرشح زجاجي. تم تركيز المادة المرشحة ، ودالتها مقابل 2 ملي مولار Tris – HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، وتم وضعها على AH-Sepharose 4B (4.0 × 18.0 سم). تمت التصفية من الإنزيم باستخدام تدرج خطي من 0-1.0 مولار كلوريد الصوديوم في 2 ملي مولار من Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0. تم جمع كسور البروتياز النشطة ، ودالتها مقابل 50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، وتركيزها عن طريق الترشيح الفائق. تم تقسيم المحلول المركز إلى جزأين ومعالجتهما بشكل منفصل بواسطة عمود تقارب STI-Sepharose 4B (3.2 × 6.0 سم). تمت التصفية من البروتين الممتز باستخدام 50 ملي جلايسين - حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 4.5 ، وتمت معادلة الشذبة على الفور باستخدام 1 مولار من Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0. تم جمع الكسر النشط ، ودالته مقابل 2 ملي مولار من Tris – HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، وتركيزه عن طريق الترشيح الفائق. بعد ترشيح الهلام على Sephadex G-50 (2.0 × 92.0 سم) باستخدام 2 ملي مولار من Tris – HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، تحتوي على 0.1 مولار كلوريد الصوديوم ، تم جمع الكسور النشطة ، وغسلها مقابل نفس المخزن المؤقت ، وتركيزها حتى 10 مل ، وتخزينها في - 15 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2.6 التلاعب في الحمض النووي

تم إجراء معالجة الحمض النووي وفقًا للطرق التي وصفها Sambrook وآخرون [23]. للتهجين الجنوبي والمستعمرة ، تم استخدام مرشحات غشاء Hybond-N + النايلون (Amersham Pharmacia Biotech AB) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء تهجين لمسبار يحمل علامة الفوسفاتيز القلوية مع شظايا الحمض النووي المعطلة في مخزن مؤقت للتهجين المباشر AlkPhos (Amersham Pharmacia Biotech AB) لمدة 16 ساعة عند 60 درجة مئوية. تم الكشف عن الإشارات الموجودة على مرشح الغشاء بإضافة كواشف NBT / BCIP للكشف عن اللون (Amersham Pharmacia Biotech AB) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

2.7 تحليل تسلسل rDNA 16S

تم إجراء PCR بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر ، والذي يحتوي على 5 ميكرولتر من 10 ×طق عازلة بوليميراز DNA ، 1.5 ملي MgCl2، أربعة ديوكسينوكليوسيد ثلاثي الفوسفات لكل منها عند 200 ميكرومتر ، و 500 نانوغرام من الحمض النووي الجيني ، و 50 ميكرومتر من البادئات ، و 2.5 وحدة من بوليميراز الحمض النووي AmpliTaq (شركة Perkin-Elmer Japan Co.). تم إجراء تضخيم الحمض النووي لمدة 30 دورة في ظل الظروف التالية: تمسخ ، 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية التلدين التمهيدي ، 55 درجة مئوية لمدة 60 ثانية والتمديد ، 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. تم تضخيم 16S rDNA بشكل انتقائي باستخدام الاشعال التالي: E15-F ، 5′-GATCATGGCTCAGATTGAAC-3 (المواضع 15–34 بكتريا قولونية 16S rDNA) و E-1456R ، 5′-TCCCGAAGGTTAAGCTACCT-3 ′ (المواضع 1456-1437).

2.8 بناء مسبار محدد ومكتبة الحمض النووي الجينومي ليسوباكتر ص. IB-9374

اثنان من البادئات قليلة النوكليوتيد المنحلة ، 5′-TG (C / T) AA (C / T) AT (A / C / T) GA (C / T) GT (A / C / G / T) GT (A / C / G / T) TG (C / T) CC-3 ′ (F1) و 5′-GG (C / T) TGCCA (C / T) TG (A / C / G / T) AC (A / G) TT (A / C / G / T) A (A / G) (A / G) TG-3 (R1) ، تم تصميمه من تسلسل الحمض الأميني N-terminal لـ Ls-LEP (CNIDVVCP المقابل لـ aa 6-13 ) وتسلسل الأحماض الأمينية الداخلية لـ A-LEP (HLNVQWQP المقابل لـ aa 177–184) [12 ، 15] ، على التوالي. يحتوي خليط التفاعل على 5 ميكرولتر من 10 ×طق عازلة بوليميراز DNA ، 1.5 ملي MgCl2، أربعة ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات لكل منها عند 200 ميكرومتر ، و 500 نانوغرام من الحمض النووي الجيني ، و 200 ميكرولتر من البادئات F1 و R1 ، و 1.25 يو من بوليميراز الحمض النووي الذهبي AmpliTaq (Perkin-Elmer Japan Co.) في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. تم إجراء تضخيم الحمض النووي في cycler درجة الحرارة (Thermal Cycler Personal Takara shuzo Co. ، كيوتو ، اليابان) ، بعد الحضانة لمدة 9 دقائق عند 95 درجة مئوية ، لمدة 40 دورة تتكون من خطوة تمسخ لمدة 1 دقيقة عند 94 درجة مئوية ، التلدين خطوة لمدة دقيقة واحدة عند 45 درجة مئوية ، وخطوة استطالة لمدة دقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية. تم إدخال جزء الحمض النووي المضخم 536-bp في ناقل pGEM T وتم تسلسله. بعد التأكد من أن جزء PCR يشفر جزءًا من Ls-LEP (aa 6–184) ، تم تحضير المسبار المحدد بواسطة كواشف AlkPhos Direct ذات العلامات (Amersham Pharmacia Biotech AB) باستخدام جزء PCR هذا.

لإنشاء مكتبة DNA الجينومية لـ ليسوباكتر ص. IB-9374 ، تم هضم الحمض النووي الكلي للكائن جزئيًا باستخدام بام مرحبًا ثم ، بدون تجزئة الحجم ، ملف بام تم ربط أجزاء HI التي تم إنشاؤها في بام ناقل كوزميد لوريست 6 مهضوم مرحبا. بعد التعبئة في المختبر في العاثية λ (شركة Promega) ، تم استخدام هذه العاثيات المؤتلفة لإصابة بكتريا قولونية DH5αMCR وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. في وقت لاحق ، بكتريا قولونية تم طلاء الخلايا على ألواح LB تحتوي على 25 ميكروغرام مل −1 نانومتر. تم تهجين مصاعد المستعمرات مع المسبار المشيد والمستعمرات التي تظهر أقوى الإشارات تم اختيارها لمزيد من الدراسات.

2.9 تحليل تسلسل النوكليوتيدات

تم تحديد متواليات النيوكليوتيدات لجينات Ls-LEP و 16S rDNA على كلا الخيطين بواسطة طريقة إنهاء سلسلة dideoxy من Sanger et al. [29] باستخدام مُسلسِل الحمض النووي الآلي التطبيقي 373A (شركة Perkin-Elmer Japan Co.). تم فحص تسلسل الحمض النووي وتسلسل الأحماض الأمينية المستخلصة باستخدام برامج تحليل التسلسل لبرنامج GENETYX (شركة تطوير البرمجيات ، طوكيو ، اليابان). أجريت عمليات بحث التنادد في قواعد البيانات باستخدام برنامج بلاست [30].

2.10 رقم انضمام تسلسل النوكليوتيدات

تتوفر بيانات تسلسل النوكليوتيدات لجين Ls-LEP و 16S rDNA من قواعد بيانات تسلسل النوكليوتيدات DDBJ و EMBL و GenBank تحت أرقام الانضمام AB045676 و AB083480 ، على التوالي.


مراجع

Geiss-Friedlander، R. & amp Melchior، F. المفاهيم في السومويل: بعد عقد من الزمان. نات. القس مول. خلية بيول. 8, 947–956 (2007).

هاي ، ر. سومو: تاريخ من التعديل. مول. زنزانة 18, 1–12 (2005).

هاي ، ر. البروتياز الخاص بـ SUMO: تطور في الذيل. اتجاهات خلية بيول. 17, 370–376 (2007).

Filosa، G.، Barabino، S.M. & amp Bachi ، A. استراتيجيات البروتينات لتحديد أهداف SUMO ومواقع القبول: مسح لبروتينات ارتباط الحمض النووي الريبي SUMOylation. ميد الجزيئي العصبي. 15, 661–676 (2013).

Vertegaal ، إيه سي وآخرون. مجموعات مميزة ومتداخلة من البروتينات المستهدفة SUMO-1 و SUMO-2 التي كشفت عنها البروتينات الكمية. مول. زنزانة. البروتيوميات 5, 2298–2310 (2006).

Golebiowski، F. et al. تغييرات على مستوى النظام لتعديلات سومو استجابة لصدمة حرارية. علوم. الإشارة. 2، ra24 (2009).

Tatham ، M.H. ، Matic ، I. ، Mann ، M. & amp Hay ، R. يحدد التحليل البروتيني المقارن دور SUMO في مراقبة جودة البروتين. علوم. الإشارة. 4، rs4 (2011).

Bruderer، R. et al. تنقية وتحديد اتحادات polySUMO الذاتية. ممثل EMBO. 12, 142–148 (2011).

بيكر ، جيه وآخرون. الكشف عن أهداف سومو الذاتية في خلايا وأنسجة الثدييات. نات. هيكل. مول. بيول. 20, 525–531 (2013).

أولسن ، جيه في وآخرون. عالمي، في الجسم الحي، وديناميكيات الفسفرة الخاصة بالموقع في شبكات الإشارات. زنزانة 127, 635–648 (2006).

شودري ، سي وآخرون. يستهدف أسيتيل اللايسين مجمعات البروتين وينظم الوظائف الخلوية الرئيسية بشكل مشترك. علم 325, 834–840 (2009).

شو ، جي ، بيج ، شبيبة. & amp Jaffrey ، S.R. التحليل العالمي لانتشار الليسين عن طريق التنميط المناعي المتبقي من اليوبيكويتين. نات. التكنولوجيا الحيوية. 28, 868–873 (2010).

Steen، H. & amp Mann، M. The ABC's (و XYZ's) لتسلسل الببتيد. نات. القس مول. خلية بيول. 5, 699–711 (2004).

Olsen ، J.V. ، Ong ، S.E. & amp Mann، M. يشق التربسين طرفًا C حصريًا لبقايا الأرجينين والليسين. مول. زنزانة. البروتيوميات 3, 608–614 (2004).

بيدريولي ، P.G. وآخرون. التعرف الآلي على مواقع SUMOylation باستخدام مقياس الطيف الكتلي وبرنامج التعرف على الأنماط SUMmOn. نات. أساليب 3, 533–539 (2006).

ماتيتش ، آي وآخرون. في الجسم الحي تحديد مواقع البلمرة البشرية الصغيرة الشبيهة باليوبيكويتين بواسطة مطياف الكتلة عالية الدقة و في المختبر إلى في الجسم الحي إستراتيجية. مول. زنزانة. البروتيوميات 7, 132–144 (2008).

Hsiao ، H.H. ، Meulmeester ، E. ، Frank ، BT ، Melchior ، F. & amp Urlaub ، H. 'ChopNSpice' ، نهج طيفي جماعي يسمح بتحديد الببتيدات المترافقة الداخلية الصغيرة مثل ubiquitin. مول. زنزانة. البروتيوميات 8, 2664–2675 (2009).

تامسالو ، ت. وآخرون. التعرف على نطاق البروتين لمواقع تعديل SUMO2. علوم. الإشارة. 7، rs2 (2014).

Raijmakers، R.، Neerincx، P.، Mohammed، S. & amp Heck، A.J. خصائص الانقسام للأخ والأخت البروتياز Lys-C و Lys-N. تشيم. كومون. (كامب) 46, 8827–8829 (2010).

Drapeau ، G.R. ، Boily ، Y. & amp Houmard ، J. تنقية وخصائص البروتياز خارج الخلية من المكورات العنقودية الذهبية. J. بيول. تشيم. 247, 6720–6726 (1972).

Impens ، F. ، Radoshevich ، L. ، Cossart ، P. & amp Ribet ، D. رسم خرائط مواقع SUMO وتحليل تغيرات SUMOylation الناتجة عن المحفزات الخارجية. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 111, 12432–12437 (2014).

هندريكس ، أ. وآخرون. الكشف عن شبكات إشارات SUMOylation العالمية بطريقة خاصة بالموقع. نات. هيكل. مول. بيول. 21, 927–936 (2014).

لاموليات ، إف وآخرون. تحليل واسع النطاق لتضخم اللايسين بواسطة التنميط المناعي المتبقي من سومو. نات. كومون. 5, 5409 (2014).

Hobbs، S.، Jitrapakdee، S. & amp Wallace، J. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 252, 368–372 (1998).

Udeshi ، N.D. وآخرون. يتيح التحضير المكرر واستخدام الجسم المضاد لبقايا الديجليسين المضاد (K-epsilon-GG) القياس الكمي الروتيني لـ 10000 ثانية من مواقع الانتشار في تجارب البروتينات الفردية. مول. زنزانة. البروتيوميات 12, 825–831 (2013).

نيلسن ، م. وآخرون. تحاكي القطع الأثرية التي يسببها اليودواسيتاميد الانتشار في قياس الطيف الكتلي. نات. أساليب 5, 459–460 (2008).

Rappsilber، J.، Mann، M. & amp Ishihama، Y. Protocol للتنقية الدقيقة والتخصيب والتجزئة المسبقة وتخزين الببتيدات للبروتيوميات باستخدام StageTips. نات. بروتوك. 2, 1896–1906 (2007).

Cox، J. & amp Mann، M. يتيح MaxQuant معدلات عالية لتعريف الببتيد ودقة الكتلة الفردية للنطاق p.p.b. وتقدير كمية البروتين على مستوى البروتين. نات. التكنولوجيا الحيوية. 26, 1367–1372 (2008).

كوكس ، جيه وآخرون. أندروميدا: محرك بحث ببتيد مدمج في بيئة MaxQuant. J. بروتيوم الدقة. 10, 1794–1805 (2011).


النتائج

فصل السلسلة

يوضح الشكل 1 أ نمطًا نموذجيًا لفصل السلسلة لكامل الهيموجلوبين في Pontodrilus matsushimensis على عمود ذي طور معكوس (Resource RPC) ، حيث تظهر أنماط SDS-PAGE في الشكل 2 أ ، ب وبالمثل ، الشكل 1 ب والشكل 3 أ ، يُظهر B نمط فصل نموذجي للهيموجلوبين الكامل لأنماط Pheretima communissima و SDS-PAGE للكسور المستخرجة من العمود ، على التوالي. في كلا النوعين ، مكونات الوحدة الفرعية هي: مونومر (الشكل 2A4 ، B4 لـ بونتودريلوس، الشكل 3A5 ، B5 لـ فيريتيما) ، أداة تقليم (الشكل 2A5 ، B5 لـ بونتودريلوس، الشكل 3A7 ، B7 لـ فيريتيما) والعديد من نطاقات البروتين بما في ذلك سلاسل الروابط (الشكل 2A1 ، 2 ، 3 ، B1 ، 2 ، 3 من أجل بونتودريلوس، الشكل 3A1 ، 2 ، 3 ، 4 ، B1 ، 2 ، 3 ، 4 لـ فيريتيما). تُظهر تحليلات كروماتوجرام FPLC و SDS-PAGE أيضًا مكونين مونومر من كل من Pontodrilus matsushimensis و Pheretima communissima. تم تحديد المكونات الموجودة في القمم التي تشير إليها الأسهم على أنها وحدات فرعية مونومر بواسطة تحليلات SDS-PAGE في ظل ظروف مخفضة وغير مخفضة. يظهر أحد المكونات الثانوية لـ Pheretima communissima monomer globins في التين. 3A6 و 3B6 لكن البعض الآخر غير معروض هنا. كانت عمليات استرداد الكرياتين المونومر الأول (المشار إليها بالقضبان في الشكل 1) بقدر 520 ميكروغرام (20.8٪) لـ Pontodrilus matsushimensis و 480 ميكروغرام (19.2٪) لـ Pheretima communissima ، عند تطبيق 2.5 مجم من كل عينة هيموجلوبين .


الأرقام

تم تحضير هيستونات دودة القز من خلايا دودة القز المستنبتة ، BmN4 (قدمها الدكتور أوكي ، جامعة كيوشو) وفقًا لـ Mitsunobu et al. (ميتسونوبو وآخرون ، 2010). تم تعليق الخلايا في محلول استخلاص (10 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.9 ، 10 ملي مول كلوريد ، 1.5 ملي مول كلوريد2، 0.34 مولار سكروز ، 10٪ جلسرين ، 0.2٪ NP-40) مكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني ، مثبطات الفوسفاتيز (Complete و PhosSTOP على التوالي ، Roche Diagnostics Ltd.) و 10 ملي بوتيرات الصوديوم. تعافت النوى على شكل حبيبات


نتائج ومناقشة

الهدف من هذا العمل هو تطوير نظام لإنتاج الكولاجين البشري الذي يمكن معالجته كيميائيًا في نهاياته من أجل تطبيقات المعالجة والتصوير المستقبلية. يعد استخدام شكل مؤتلف من البروتين مفيدًا ، لأنه يسمح بإجراء تحقيقات مستقبلية لتأثيرات الطفرات النقطية على بنية وميكانيكا الحلزون الثلاثي. تحقيقًا لهذه الغاية ، نصف تعديل نظام التعبير المؤتلف المطور سابقًا للنوع الثاني من procollagen البشري 17 الذي يقدم تسميات كيميائية خاصة بالموقع داخل ما يسمى بمصطلح telopeptide للشكل الناضج للبروتين.

استراتيجية الطفرات

تم استخدام فحص التسلسل لتحديد المواقع التي يحتمل أن تكون مسموحًا بها للطفرات الموضحة في الفقرات التالية ، والتي تسمح باستخدام الكيمياء التساهمية في كل نهاية. يوضح الشكل 1 بشكل تخطيطي مواقع الطفرات المرغوبة. يتم إدخال كل من الطفرات الطرفية N و C في مواقع داخلية لمواقع انشقاق Lys-C ، بحيث تظل العلامات بعد هضم البروببتيدات بواسطة هذا الإندوببتيداز 22 أو الكيموتريبسين 17 (الحلزون الثلاثي مقاوم للهضم من قبل معظم البروتياز. ). العلامات خارجية إلى المجال الحلزوني الثلاثي لتقليل التأثير المحتمل على طي الكولاجين ، والذي يمكن أن يكون مصدر قلق خاص بالقرب من الطرف C. 23-25

البقايا الأكثر استخدامًا لاستهداف البروتينات الخاصة بالموقع هي السيستين. توفر السيستين وصولاً سهلاً إلى التعديل الكيميائي للبروتينات بسبب شقوق السلفهيدريل. في حين أن السيستين موجودة في مجالات البروبتيد للكولاجين وقد تم استخدامها لوضع العلامات المحددة للبروكولاجين ، فإن الإزالة المحللة للبروتين من بروبتيدات N- و C- أثناء المعالجة إلى الشكل الناضج للكولاجين ، التروبوكولاجين ، يعني أنه من الضروري إيجاد أو إدخال سلاسل جانبية مستهدفة داخليًا في التروبوكولاجين نفسه.

يعتبر الكولاجين من النوع الثالث فريدًا من نوعه بين الكولاجين الليفي من حيث أنه يمتلك السيستين داخل منطقة تيلوببتيد C- الطرفية ، وهي ميزة تم استخدامها سابقًا لوضع العلامات الخاصة بالموقع على هذا البروتين. 16 لا يمتلك الكولاجين من النوع الثاني السيستين ، مما يتطلب طفرة لإدخال هذه الوظيفة. قمنا بتصميم طفرة Ser1221Cys في منطقة تيلوببتيد C- الطرفية للكولاجين من النوع الثاني ، بهدف الحد الأدنى من تعطيل البنية المحلية وطي اللولب الثلاثي ، مع تقديم الوظيفة الكيميائية للثيول المطلوبة إلى منطقة نهاية البروتين الناضج.

بالنسبة للتطبيقات مثل التحليل الطيفي لقوة الجزيء الفردي ، فمن المرغوب فيه وضع علامات مميزة على طرفي الكولاجين. يتطلب هذا التمييز استخدام ملصقين كيميائيين متعامدين. تحقيقًا لهذه الغاية ، سعينا إلى مجموعة كيميائية إضافية يمكن معالجتها في ظروف تحافظ على بنية البروتين المطوية بشكل صحيح ، والتي كانت متوافقة واقتصادية في سياق نظام التعبير عن الخلايا البشرية المستخدم. تقدم الألدهيدات مثل هذه الميزة ، حيث توفر سهولة التفاعل مع الشقوق المسمى هيدرازيد والهيدرازيد في المحاليل المائية ودرجات الحرارة المحيطة. تم إدخال 26 الألدهيدات سابقًا في الطرف N للكولاجين عن طريق التفاعل مع الجزيء الصغير بيريدوكسال 5′-فوسفات (PLP). 13 ، 16 نقترح إستراتيجية بديلة تنتج الألدهيدات داخليًا. هذا من شأنه أن يسهل وضع العلامات في التجارب المستندة إلى الخلايا.

يولد إنزيم توليد الفورميل جليسين (FGE) بقايا فورميل جليسين (FGly) التحفيزية في الموقع النشط لأنزيمات الكبريتاز عن طريق التعديل اللاحق للترجمة لسيستين محفوظ ضمن تسلسل التعرف الخطي القصير الذي يتكون من الحد الأدنى من الحافز CxPxR. 18 ، 19 ، 27 تم استخدام FGEs المؤيدة وحقيقية النواة لإدخال وظائف الألدهيد في البروتينات المؤتلفة عبر تعديل FGly للسيستين ضمن التسلسل المستهدف الذي يتم إدخاله في مواضع مختلفة من البروتين الهندسي. وقد تم ذلك بنجاح في أنظمة التعبير البكتيرية والثديية. 27-30 حقيقيات النوى FGE موضعية في الشبكة الإندوبلازمية ، 20 حيث تحدث أيضًا تعديلات أولية بعد الترجمة للبروكولاجين. 31 يوحي التوطين المشترك لهذه البروتينات بفرصة تفاعل FGE مع تسلسل مستهدف على procollagen. لتمكين هذا التعديل للكولاجين ، قدمنا ​​التسلسل المستهدف لـ LCTPSR ، وهو تسلسل تم التعرف عليه بواسطة FGE ، 18 باستخدامه ليحل محل تسلسل النوع البري لـ LGVMQ داخل تيلوببتيد N-terminal. السيستين الذي تحته خط هو البقايا المستهدفة للتحويل الإنزيمي إلى فورميل جليسين.

الاستنساخ والتعبير وتنقية البروكولاجين البشري المتحور

قمنا باستنساخ التركيبات وإنشاء خلايا ساركومة ليفية بشرية مستقرة (HT1080) تعبر عن النوع الثاني من البروكولاجين ، وتحولت عند الطرف N لتقديم تسلسل التعرف على FGE لتعديل الألدهيد وعند الطرف C لإدخال السيستين. تم تصوير البروتين الذي يجب أن ينتج بشكل تخطيطي في الشكل 1. لإنتاج النوع الثاني من البروكولاجين ، تم استنساخ الكولاجين المتحور في خط خلية HT1080 مصمم هندسيًا لإفراط ثابت في التعبير عن FGE. 19 ، 20 خلية مستقرة تم إنتاجها وتمييزها بشكل أساسي كما هو موصوف سابقًا للبروتين من النوع البري في خط خلية HT1080 قياسي. 17

تمت تنقية النوع الثاني من procollagen من الوسائط ، باتباع الإجراء الموصوف لـ wildtype procollagen. 17 هذا تحقق من أن التعديلات المدخلة N و C يتم التسامح معها ولا تمنع الطي والإفراز المناسبين. 31

قارن اختبار إضافي بين فعالية تبادل الأنيون التقليدي مع التبادل الكاتيوني للتنقية. تنقية التبادل الكاتيوني ، باستخدام المخزن المؤقت الحمضي ، يسهل وضع العلامات الكيميائية اللاحقة على جزء الألدهيد (انظر أدناه) ، لأنه يزيل الحاجة إلى خطوة غسيل الكلى الإضافية. على الرغم من أن procollagen مستخرج بشكل غير مفاجئ من عمودين مختلفين بملفات تعريف مختلفة ، إلا أن العوائد من النهجين المختلفين كانت متشابهة.

لتفاعلات الوسم اللاحقة ، تم هضم procollagen المنقى مع chymotrypsin لإزالة البروببتيدات. 17 الشكل 2 يوضح نقاء البروتين الناتج.

نقاوة عالية من الكولاجين من النوع الثاني مزدوج الطافرة التي أظهرتها SDS-PAGE. يعمل الكولاجين ذو الطفرات المزدوجة (الذي يتم الحصول عليه من هضم كيموتريبسين من حق البروكولاجين المنقى) كفرقة واحدة في هلام مفسد للطبيعة. لا يمكن تمييز الحركية عن تلك الموجودة في بروتين النوع البري (يسار).

التقييم الوظيفي: التجميع الذاتي في ألياف مرتبة

للتحقق من الوظيفة ، قمنا بتقييم قدرة الكولاجين المتحور على تكوين ألياف كولاجين عالية الترتيب في المختبر, which was assessed by imaging the fibrils with transmission electron microscopy (TEM). To generate a form of collagen capable of fibril formation, propeptides were removed by incubation with lysyl endopeptidase Lys-C, generating a form of collagen capable of self-assembly into well-ordered fibrils. 17 , 22 Fibril formation proceeded spontaneously in a solution of phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.3, at 37°C.

TEM images of the resultant fibrils show that they display distinct light/dark D-periodic banding patterns (Figure 3). This is a distinguishing feature of well-ordered collagen fibrils. The periodicity is in the range of 65-70 nm, as expected. 32 , 33 These images demonstrate that the introduced mutations do not affect collagen’s ability to self-assemble into highly ordered fibrillar structures.

Transmission electron microscopy (TEM) imaging demonstrates that the double-mutant type II collagen can self-assemble to form well-ordered fibrils, as exemplified by the periodic banding pattern. Two representative images of the resulting fibrils are shown. Scale bars = 200 nm.

Chemical labelling

The mutations introduced into the N- and C-telopeptides aimed to present orthogonal functional groups for covalent modification. While sequence analysis confirmed the presence of the mutations, it remained to be determined whether the N-terminal FGE sequence had been enzymatically modified to present an aldehyde, and furthermore, whether or not the functional groups were chemically accessible within the folded, secreted protein.

Accessibility of thiols from the cysteine residues was probed by reaction with biotinmaleimide. To eliminate the possibility of unwanted reactions with sulfhydryl groups of cysteines endogenously present in collagen’s propeptide regions, the propeptides were removed by chymotrypsin digestion. Following reduction of the resulting collagen to generate thiols (see Methods), we observed that the double-mutant collagen indeed reacted with biotin-maleimide, as it produced a strong signal in a Western blot with streptavidin (Figure 4). By contrast, similarly treated wildtype protein gave no signal, demonstrating that thiol functionality is a result of the introduced mutations. Because cysteines were introduced into each telopeptide end of collagen, the observed reactivity with maleimide does not assay for conversion of the C-terminal cysteine into formylglycine, but does demonstrate the successful introduction of reactive thiols.

Western blotting shows that the double-mutant type II collagen is successfully labelled using maleimide-biotin. Following reaction of chymotrypsin-digested procollagen with maleimide-biotin, (a) the presence of biotin was probed for with streptavidin, while (b) blotting with an anti-collagen antibody cocktail confirmed similar amounts of double-mutant (DM) and wild-type (WT) collagen were loaded. Numbers indicate the relative amounts loaded in each lane. Biotinylation of sulfhydryls is specific to the double-mutant collagen.

To assay for presence and accessibility of the N-terminal aldehyde, we reacted the purified protein with biotin-hydrazide. 28 Success of this reaction should demonstrate both that the cysteine within the FGE recognition sequence was enzymatically converted to aldehyde, and that it remains accessible to subsequent chemical labelling following folding and secretion. Unfortunately, these results demonstrated roughly equal reactivity of the double-mutant and wild-type proteins with hydrazide (Figure 5). Many replications of these results, under different reaction conditions, led us to conclude that aldehyde groups are present not only in the double-mutant but also in the wild-type recombinant protein. 12

Western blotting shows that both the double-mutant and wild-type recombinantly expressed type II collagen are biotinylated, following reaction targeting aldehydes with hydrazide-biotin. (a) The presence of biotin was probed for with streptavidin, and (b) blotting with an anti-collagen antibody cocktail confirmed similar amounts of double-mutant (DM) and wild-type (WT) collagen were loaded. Numbers indicate the relative amounts loaded in each lane. Results indicate that aldehydes are present in both the double-mutant and wild-type collagen.

It appears that, contrary to our expectation, molecular collagen can undergo post-translational modification to introduce aldehydes. It is well known that as part of its production, assembly and secretion pathway, collagen undergoes extensive posttranslational processing. 34 In the endoplasmic reticulum, prolines are hydroxylated and lysines hydroxylated, with hydroxylysines acting as subsequent targets for O-linked glycosylation. 34 These modifications have been identified also in our wild-type recombinant procollagen. 17 Aldehyde-producing posttranslational modifications in collagen have been attributed to lysyl oxidase enzymes, which act to convert lysine and hydroxylysine to allysine and hydroxyallysine, بمعنى آخر., their peptidyl aldehyde counterparts. 34 This activity has generally been believed to occur extracellularly, stimulated by association of collagen into its fibrillar form. 34 Aldehydes subsequently react to create crosslinks that stabilize fibrillar collagen. 35 While the presence of aldehydes in tissue-derived collagen is not surprising, it was unexpected to discover them within our recombinantly expressed procollagen. So either allysine and/or hydroxyallysine were generated extracellularly, independent of stable fibril formation, or lysyl oxidase re-enters the cell and oxidizes collagen intracellularly. 36 The study of collagen processing could benefit from the use of human-cell-based expression systems such as this, 37 which are amenable to manipulation. Care must be taken, however, to infer too much from results utilizing a cell line that does not endogenously produce high levels of fibrillar collagens.

To provide additional evidence that the observed reactivity with hydrazide was due to aldehydes, we examined hydrazide reactivity of collagens from other sources that have different types of post-translational modifications. We reacted hydrazide-biotin with commercially available collagens, type I from rat tail tendon and human type III recombinantly expressed in yeast cells. Based on the discussion of the previous paragraph, we anticipated that the tissue-derived sample would possess aldehydes and that the collagen recombinantly expressed in yeast, which lacks most of the enzymes required for posttranslational processing of collagen, 38 would not. Our results confirmed these expectations (Figure 6): type I collagen from rat reacted with hydrazide-biotin, while collagen produced from yeast did not. The yeast-derived collagen did, however, react with hydrazide-biotin following incubation with pyridoxal 5′-phosphate (PLP), which has been shown to modify N-termini of proteins to aldehydes. 39 If yeast-expressed collagen, produced with only prolyl hydroxylation as a post-translational modification, is sufficient for experiments, then aldehyde modification via the PLP small-molecule reaction offers easy access to labelled collagen. 13 , 16 However, if collagen harboring a more complete suite of modifications is desired, a different cell line must be used. 38 Based on the findings of this work, we propose that inhibition 34 or a knockout of lysyl oxidase in a human-cell-based recombinant expression system could result in the ability to introduce aldehydes in collagen uniquely located within the FGE recognition sequence and available for specific chemical tagging. This remains to be tested.

Western blotting with streptavidin-HRP demonstrates the differences in composition between tissue-derived and yeast-expressed collagen. Type I collagen from rat tail (Col I) reacts with biotin-hydrazide (Hyd), demonstrating the presence of endogenous aldehydes in this sample, while human type III collagen produced recombinantly in yeast (Col III) does not. Following incubation of this type III collagen with the small molecule PLP to introduce aldehydes (Col III + PLP), the protein becomes reactive to biotin-hydrazide. Replicates in the right lanes are at half the loading concentration as on the left. α1 and α2 refer to the two component chains of the heterotrimeric (α1)22)1 type I collagen triple helix, while type III collagen, like type II, consists of three identical α chains. β bands refer to two crosslinked α-chains. These are a standard feature seen in SDS-PAGE gels of collagen and predominantly arise from crosslinking between chains within a triple helix.


المواد والأساليب

Cell culture and Preparation of plasma membrane vesicles

CHO B30 cells were grown in alpha-minimum essential medium supplemented with glutamine, nucleosides, 10% calf serum, and 30 µg·mL −1 colchicine [ [13] ]. Plasma membrane vesicles were prepared from 50 culture plates per batch [ [16] ].

Detection of radioactivity

For the detection of radioactivity, the gels were exposed to a Fuji imaging plate type BAS-IIIs. Liquid samples were measured in a Compu γ-counter (LKB Wallac, Vienna, Austria).

Photoaffinity labeling

[ 125 I]-Iodomycin (2000 Ci·mmol −1 ) was prepared from daunomycin by reaction with [ 125 I]-labeled Bolton–Hunter reagent as described previously [ [15] ]. For photoaffinity labeling, 75 µg plasma membrane protein and [ 125 I]-labeled iodomycin (0.10 pmol per 10 µg protein) were suspended in 150 µL 5 m m Tris/HCl, pH 7.5, with 8.6% sucrose (w/v) in a quartz cuvette, and were illuminated for 15 min with visible light, emitted from a 500-watt xenon lamp that had passed through two 3-cm filters of water and a saturated aqueous CuSO4 solution and a cutoff filter of 450 nm. Protein was precipitated with ice-cold EtOH (final concentration 70% (v/v)) at −20 °C for 4 h.

Chemical fragmentation

Photoaffinity-labeled plasma membrane proteins (75 µg) were cleaved with BNPS-skatol [ [17] ]. The precipitated protein was dissolved in 7.5 µL of H2O and 22.5 µL of the following mixture: 1.3 mg of BNPS-skatol (Fluka) dissolved in 1 mL of 100% acetic acid. The reaction was carried out at 47 °C for 18 h. The digest was stopped by diluting the mixture with 24 µL of H2O. The cleavage products were concentrated in an evaporator and analyzed on a 15 × 17 × 0.1 cm preparative 4%/12% discontinuous Tricine/PAGE [ [18] ].

Three milligram plasma membrane protein turned out to be necessary to purify sufficient amounts of samples of peptide for the final Edman sequence analysis. Two gels were used each of which was loaded with 20 photoaffinity-labeled samples of 75 µg plasma membrane protein.

Purification of the [ 125 -I]-Iodomycin-labeled Skatol fragment

The [ 125 I]-iodomycin-labeled peptide of lowest molecular weight was gel-eluted from the discontinuous Tricine gel onto a 3 kDa cutoff membrane in a Centrilutor (Amicon, Merck, Darmstadt, Germany) as described previously [ [16] ]. Excess volume was removed by centrifugation of the centricon tubes at 4 °C at 7500 ز. This solution was washed three times by ultrafiltration with 3 mL of 5 m m Tris/HCl, pH 7.5, to remove SDS to the greatest possible extent. Subsequently, the concentrated peptide solution was removed from the filtration unit and supplemented with guanidinium hydrochloride to a final concentration of 6 m . The peptide solution was separated on a phenyl column (Macherey & Nagel, ET 50/3 Nucleosil 100-5 C6H5) by high-performance liquid chromatography (HPLC) reversed-phase chromatography as described [ [16] ]. Solvent A contains 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) solvent B, 60% acetonitrile, 20% isopropanol, and 0.1% TFA.

Cleavage with Endoproteinase Lys-C

The HPLC fraction that contained the iodomycin-labeled peptide was dried in an evaporator and digested with 0.02 µg lysyl endopeptidase from Achromobacter (WAKO 129-02541, Neuss) at 37 °C for 24 h in 50 m m Tris pH 9 10% glycerol 1% SDS and 0.05% (w/v) bromophenol blue in a maximum volume of 20 µL. Immediately before application to the gel, 0.04 µL mercaptoethanol was added to the sample buffer to act as a scavenger for nonpolymerized acrylamide. The cleavage products were separated on a 13% Tricine/PAGE (const. 40 V, 16 h), and afterward, the gel was exposed to an imaging plate.

Purification of the Lys-C cleavage product

The photoaffinity-labeled peptide was gel-eluted in a dialysis tube with a molecular weight cutoff of 2 kDa (Serva Spectra/Por 44 166) for 6 h in 50 m m NH4HCO3 buffer with 0.06% SDS and for a further 15 h in the same buffer without SDS [ [19] ]. Without addition of further chemicals, the peptide was purified by HPLC reversed-phase chromatography (HPLC Basic System 800, 9003-0800) on a phenyl-hexyl column (Luna 00B-4257-BO Phenomenex, Aschaffenburg, Germany), which was used together with a security guard (Phenylpropyl AJO-4350 Phenomenex). The gradient was held at 5% B to inject the sample and run after start in 15 min from 5% to 70% B, in 20 min from 70% to 80% B, in 15 min from 80% to 90% B, in 15 min from 90% to 99% B, 5 min hold at 99% B, and in 5 min from 99% to 5% B. The flow rate was 100 µL·min −1 . Solvent A contains 0.1% TFA solvent B, 60% acetonitrile, 20% isopropanol, and 0.1% TFA.

Analysis of the Lys-C cleavage product by Edman sequence analysis

Peptides were sequenced on a pulsed liquid-phase Applied Biosystems 477A protein sequenator with a 120A on-line HPLC system: The HPLC fractions were acidified with 1% TFA (final) and then applied to ProSorb™ polyvinylidene fluoride sample preparation cartridges. Cartridges were washed and coated with polybrene according to the manufacturer's instructions. The sequenator was run with standard reaction and conversion cycles. All sequencer reagents were obtained from PE Biosystems.

For the on-line phenylthiohydantoin (PTH) amino acid analysis, we used a Shandon Hypersil ODS Column (250 × 1.6 mm, 5 µm) at 46 °C with buffer A 3.5% tetrahydrofuran (Fluka, spectroscopy grade) adjusted to pH 4 with 9.7 mL of 3 m sodium acetate buffer (pH 3.8) and 0.3 mL triethylamine (Pierce, sequencing grade, Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Germany) and buffer B / 100% acetonitrile (Scharlau, ultragradient grade) with 250 n m dimethylphenylthiourea at a flow rate of 125 µL·min −1 . The gradient was 14 min held at 11% B, in 0.5 min from 11% to 15% B, in 6 min from 15% to 23% B, in 12 min from 23% to 41% B, 9 min held at 41% B, in 0.5 min from 41% to 90% B, and 5 min held at 90% B.


نقاش

During the course of this study, the biochemical properties of Pheretima hilgendorfi hemoglobin reported in previous studies (Ochiai, 1979 Ochiai and Enoki, 1979) were mostly confirmed: two-heme containing subunits, a monomer and a disulfide-linked trimer and a linker comprising two or three chains. Subunits containing heme were identified by the method of Granath (1988) in the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis without denaturation (data not shown). As for the molecular weight of monomer globin, the previous study (Ochiai and Enoki, 1979) estimated it to be 13,100 +/− 200 (non reduced form) and 13,700 (reduced form) based on SDSpolyacrylamide gel electrophoreses. After sequenced, however, the value was calculated to be 16,107 Da, which is comparable to those of other monomer globins of Pheretima sieboldi (16,911 Da Suzuki, 1989), Lumbricus (16,750 Da Shishikura وآخرون., 1987), Tubifex (16,286 Da Stern وآخرون., 1990) and Tylorrhynchus (16,327 Da Suzuki وآخرون., 1982).

The complete amino acid sequence of the monomer globin of Pheretima hilgendorfi , which is the second report on the primary structure of the Pheretima group, is aligned with that of the homologous globins of four oligochaetes and one polychaete (Fig. 5). Several interesting similarities and differences were observed: The chain length of the globin sequence of Pheretima hilgendorfi is a 140-residue protein and others are 141 residues for Pheretima sieboldi , 142 residues for Lumbricus, 141 residues for Tubifex and 139 residues for Tylorrhynchus. There are 54 invariant amino acid residues among the four monomer globins of oligochaetes except for the marine polychaete, Tylorrhynchus. These invariants include the relative positions of the two histidine residues (residues 61 and 93) for heme coordination. The monomer globin of Pheretima hilgendorfi contains two cysteine residues linked at positions 2 and 130. These data, taken together with the comparison of partial amino-terminal sequences of the heme containing chains of trimer of Pheretima hilgendorfi (data not shown) suggest that the Pheretima hilgendorfi hemoglobin's constituents can be separated into two strains, strain A and B by Gotoh (Gotoh وآخرون., 1987) as previously set up in the study of tetrameric Lumbricus terrestris hemoglobin, in which the earthworm's hemoglobin is, in general, akin to the divergence of the α- and β-globins of vertebrate hemoglobins. The monomer globin sequence of Pheretima hiigendorfi , therefore, belongs to the A-strain that already contains the sequences of chains I and IIA of Tyiorrhynchus (Suzuki وآخرون., 1982 Suzuki and Gotoh, 1986), chains I and b of Lumbricus (Shishikura وآخرون., 1987 Fushitani وآخرون., 1988) and chain I of Tubifex (Stern وآخرون., 1990).

One of the most significant characteristics of this comparison of the alignment of the four globins of oligochaetes is the presence of a missing residue at position 20 in the amino-terminal region of Pheretima hiigendorfi (Fig. 5). This missing residue can not be found in the other homologous parts of known monomer sequences of oligochaetes or polychaetes. The secondary structure of monomer globin of Pheretima hiigendorfi shows that the missing residue corresponds to a part of the connection between A and B helices (Fig. 5). However, it is still an unresolved question why the deletion of amino acids can occur in the sequence of monomer globin of Pheretima hiigendorfi and not in that of other unrelated species of annelids.

The 82% amino acid sequence identity between the two Pheretima species indicates high similarity of each lineage. According to the hypothesis of two strains of globins (Gotoh وآخرون., 1987), the evolutionary divergence pattern of species depends on finding orthologous subunits in many homologues. In the cases of the two species of Pheretima, each of the monomer globins is sharing orthologous relationship and shown to have a closer divergence pattern than the globins belong to other strain. This is true in recent studies on sea cucumber hemoglobins (McDonald وآخرون., 1992) as well as on arthropod hemocyanins (Sugita and Shishikura, 1995). Especially, the sea cucumber C globin from Caudina (Molpadia) arenicola (McDonald وآخرون., 1992) shares a 60% sequence identity with the sequenced D globin from the same species (Mauri وآخرون., 1991), however, has a greater sequence identity of 93.6% with a globin from a different species of sea cucumber, Paracaudina chilensis (Suzuki, 1989b). Similar type of relationships are seen in hemocyanin molecules of horseshoe crabs: Although only a 57% sequence identity was found in immunological unrelated hemocyanin subunits, a hemocyanin subunit, HT6, from Tachypleus tridentatus shares a 97.3% identity with the sequenced hemocyanin subunit, HR6, from a different species Carcinoscorpius rotundicauda , since HT6 and HR6 have been shown to be immunological related hemocyanin subunits (Sugita and Shishikura, 1995). Hence, if attention is paid to the use of globin sequence data of orthologous relationship, we can deduce a reliable evolutionary divergence pattern of the Pheretima مجموعة. Therefore, a study of the molecular evolution of the genus Pheretima is in progress.

A more recent study on monomer globin of Pheretima communissima shows that only four variants (at the 1st, the 16th, the 21st and the 25th positions) and no deletion of amino acid residue were observed as compared with both first 40 amino-terminal amino acid sequences of orthologous globins of Pheretima hiigendorfi and Pheretima communissima (data not shown).


نتائج ومناقشة

Purification of prothrombin activator from T carinatus venom.

The procoagulant effects of the venom of T carinatus are well known.20,21 A factor Xa-like activity responsible for these procoagulant effects was partially purified by Morrison et al.22 Recently, Marsh et al12 isolated and partially characterized the prothrombin activator and showed that it belongs to group II. We purified it to homogeneity from T carinatus venom as follows. The crude venom was separated into eight fractions on a Superdex 75 gel filtration column (Fig 1A). Procoagulant fractions were pooled and subfractionated using anion exchange chromatography on a UNO Q-1 column (Fig 1B). Of the eight fractions obtained, procoagulant activity was found only in fraction 6. This fraction was homogeneous, as judged from its RP-HPLC profile (Fig 1C). This procoagulant protein was named trocarin in accordance with the recommendations of the Subcommittee for the Nomenclature of Exogenous Hemostatic Factors.23 It comprised approximately 5% of total venom protein (wt/wt). Trocarin is not highly soluble in aqueous buffers (pH 3.0 to 7.5). When pure, it dissolves only up to approximately 1 mg/mL. Its late elution on a Nucleosil C18 column also indicates its hydrophobic nature.

Purification and determination of homogeneity of trocarin. (A) Gel chromatography of T carinatus venom on a Superdex 75 column. Flow rate: 1.5 mL/min. Procoagulant activities of all fractions were tested and fractions indicated by a horizontal bar were pooled. (B) Subfractionation of pooled procoagulant fraction by anion exchange chromatography on a UNO Q-1 column. Bound proteins were eluted by a linear gradient of NaCl. Flow rate: 2 mL/min. Procoagulant activities of all fractions were tested and fractions indicated by a horizontal bar were pooled. (C) RP-HPLC of fraction 6 from UNO Q-1 column. Column: Nucleosil C18. Bound proteins were eluted by a linear gradient of buffer B (80% ACN in 0.1% TFA). Flow rate: 2 mL/min. The procoagulant protein peak is labeled as trocarin. (D) Capillary zone electropherogram of trocarin. Electrophoresis runs of the protein (1 mg/mL) were performed on a BioFocus 3000 HPCE system (Bio-Rad) using a coated capillary (24 cm × 25 μm) from positive to negative polarities at 12 kV. Buffer: 100 mmol/L phosphate buffer, pH 2.5. Temperature: 18°C. Duration: 20 minutes. Sample injected using pressure mode 10 psi/s. Trocarin migrates as a single peak at 4.32 min.

Purification and determination of homogeneity of trocarin. (A) Gel chromatography of T carinatus venom on a Superdex 75 column. Flow rate: 1.5 mL/min. Procoagulant activities of all fractions were tested and fractions indicated by a horizontal bar were pooled. (B) Subfractionation of pooled procoagulant fraction by anion exchange chromatography on a UNO Q-1 column. Bound proteins were eluted by a linear gradient of NaCl. Flow rate: 2 mL/min. Procoagulant activities of all fractions were tested and fractions indicated by a horizontal bar were pooled. (C) RP-HPLC of fraction 6 from UNO Q-1 column. Column: Nucleosil C18. Bound proteins were eluted by a linear gradient of buffer B (80% ACN in 0.1% TFA). Flow rate: 2 mL/min. The procoagulant protein peak is labeled as trocarin. (D) Capillary zone electropherogram of trocarin. Electrophoresis runs of the protein (1 mg/mL) were performed on a BioFocus 3000 HPCE system (Bio-Rad) using a coated capillary (24 cm × 25 μm) from positive to negative polarities at 12 kV. Buffer: 100 mmol/L phosphate buffer, pH 2.5. Temperature: 18°C. Duration: 20 minutes. Sample injected using pressure mode 10 psi/s. Trocarin migrates as a single peak at 4.32 min.

The homogeneity of trocarin was determined by capillary zone electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry. The electropherogram (Fig 1D) shows a single peak, indicating a single molecular species. The mass spectrum (data not shown) showed peaks of mass/charge ratios ranging from 19 to 38 charges and the molecular mass of trocarin was found to be 46,515 based on the reconstructed spectrum. Some preparations showed a variation in molecular mass (±0.1%). This is most likely due to heterogeneity in glycosylation or fragmentation of carbohydrate groups during mass spectrometry, because, during sequence determination, no heterogeneity in any amino acid residue was observed.

Procoagulant activity and catalytic properties of trocarin.

Trocarin exhibits potent procoagulant effects. It shortened the recalcification time of human plasma (control clotting times of 161 seconds) to 22 seconds at a concentration of 16.9 nmol/L (Fig 2). A similar procoagulant protein has been isolated from T carinatus venom,12which is known to clot factor X-deficient plasma, but not factor V- and II-deficient plasmas, suggesting that it activates prothrombin and requires factor V for optimum activity. Furthermore, like all group II prothrombin activators and factor Xa, its blood clotting activity was enhanced by the addition of phospholipids and Ca 2+ ions.12 We determined the effect of Ca 2+ ions, negatively charged phospholipid vesicles (9:1 PC:PS), and bovine factor Va on the rate of bovine prothrombin activation by trocarin and factor Xa (bovine and human). The addition of Ca 2+ ions, phospholipids, and factor Va greatly stimulates the activity of trocarin (Table 1), confirming that it is a group II prothrombin activator. Trocarin has a higher basal activity in the absence of all cofactors compared with bovine and human factor Xa. The stimulation of trocarin by the cofactors is generally about an order of magnitude lower than that of bovine and human factor Xa. The complete complex containing trocarin is twofold and fourfold less active than prothrombinase complexes containing bovine and human Xa, respectively (Table 1). This could be due to subtle differences in the interaction between reptilian and mammalian enzymes with mammalian factor Va. In addition, optimal cofactor concentrations for trocarin may be different from those for mammalian enzymes.

Effect of trocarin on coagulation of human and python plasma. Procoagulant activity measured by determining recalcification time of plasmas in the presence of various amounts of trocarin or human factor Xa using BBL fibrometer at 37°C. Clotting of plasma was initiated by the addition of CaCl2. Trocarin shows very similar procoagulant effects to human factor Xa on both human and python plasma.

Effect of trocarin on coagulation of human and python plasma. Procoagulant activity measured by determining recalcification time of plasmas in the presence of various amounts of trocarin or human factor Xa using BBL fibrometer at 37°C. Clotting of plasma was initiated by the addition of CaCl2. Trocarin shows very similar procoagulant effects to human factor Xa on both human and python plasma.

Effect of Ca 2+ Ions, Phospholipids, and Bovine Factor Va on Trocarin- and Factor Xa-Mediated Prothrombin Activation

Activator . الخامس (pmol prothrombin/ min/μg) . Relative Rate .
Trocarin 0.81 1
Trocarin, Ca 2+ 93 115
Trocarin, Ca 2+ , PL 3,617 4,465
Trocarin, Ca 2+ , Va 2,091 2,581
Trocarin, Ca 2+ , PL, Va 12,809 15,814
Bovine Xa 0.19 1
Bovine Xa, Ca 2+ 241 1,268
Bovine Xa, Ca 2+ , PL 9,687 50,984
Bovine Xa, Ca 2+ , Va 2,757 14,511
Bovine Xa, Ca 2+ , PL, Va 26,155 137,658
Human Xa 0.08 1
Human Xa, Ca 2+ 205 2,563
Human Xa, Ca 2+ , PL 20,407 255,088
Human Xa, Ca 2+ , Va 4,668 58,350
Human Xa, Ca 2+ , PL, Va 49,132 614,150
Activator . الخامس (pmol prothrombin/ min/μg) . Relative Rate .
Trocarin 0.81 1
Trocarin, Ca 2+ 93 115
Trocarin, Ca 2+ , PL 3,617 4,465
Trocarin, Ca 2+ , Va 2,091 2,581
Trocarin, Ca 2+ , PL, Va 12,809 15,814
Bovine Xa 0.19 1
Bovine Xa, Ca 2+ 241 1,268
Bovine Xa, Ca 2+ , PL 9,687 50,984
Bovine Xa, Ca 2+ , Va 2,757 14,511
Bovine Xa, Ca 2+ , PL, Va 26,155 137,658
Human Xa 0.08 1
Human Xa, Ca 2+ 205 2,563
Human Xa, Ca 2+ , PL 20,407 255,088
Human Xa, Ca 2+ , Va 4,668 58,350
Human Xa, Ca 2+ , PL, Va 49,132 614,150

The cleavage products obtained by trocarin-mediated prothrombin activation were examined by SDS-PAGE on a nonreducing gel. The electrophoretic pattern was identical to that for prothrombin cleavage products by human Xa (Fig 3). Human factor Xa cleaves bovine prothrombin at two sites, Arg 274-Thr 275 and Arg 323-Ile 324. We determined the cleavage site(s) of prothrombin by trocarin in the presence of factor Va and Ca 2+ ions. Amino-terminal sequencing of the first four residues of one of the cleavage products (Mr, 38 kD) yielded two parallel sequences, Thr-Ser-Glu-Asp and Ile-Val-Glu-Gly. These correspond to the amino-termini of the light and heavy chains of thrombin generated when cleavage of prothrombin occurs at Arg 274-Thr 275 and Arg 323-Ile 324. This indicates that trocarin has identical cleavage specificities to mammalian factor Xa, cleaving both peptide bonds of bovine prothrombin required for conversion to physiological thrombin. This is in contrast to group IA and IB activators, which cleave only one peptide bond, converting prothrombin to meizothrombin.5,6

SDS-PAGE analysis of prothrombin activation. Prothrombin (5 μg) was activated with trocarin or human factor Xa (5 ng each) in the presence of Ca 2+ ions (5 mmol/L), 9:1 PC:PS phospholipid vesicles (100 μmol/L), and factor Va (10 nmol/L) at 37°C for 4 hours. The reaction mixture was loaded on a nonreducing 4% to 20% gradient gel. Untreated prothrombin (lane a), cleavage products of prothrombin by trocarin (lane b), and factor Xa (lane c) were electrophoresed according to Laemmli.15

SDS-PAGE analysis of prothrombin activation. Prothrombin (5 μg) was activated with trocarin or human factor Xa (5 ng each) in the presence of Ca 2+ ions (5 mmol/L), 9:1 PC:PS phospholipid vesicles (100 μmol/L), and factor Va (10 nmol/L) at 37°C for 4 hours. The reaction mixture was loaded on a nonreducing 4% to 20% gradient gel. Untreated prothrombin (lane a), cleavage products of prothrombin by trocarin (lane b), and factor Xa (lane c) were electrophoresed according to Laemmli.15

We tested the amidolytic activity of trocarin on a synthetic substrate specific for factor Xa. Trocarin did cleave S-2222, indicating identical sequence specificity of cleavage to factor Xa. We determined the Kم and Vالأعلى for the S-2222 hydrolysis by trocarin and human and bovine factor Xa (Table 2). Whereas the Kم’s for the three enzymes are comparable, the Vالأعلى of trocarin is approximately 800 and 1,400 times lower than that of human and bovine factor Xa, respectively. Similar results were reported earlier with notecarin. It showed approximately 120-fold lower amidolytic activity than bovine factor Xa on CBS 31.39, the best synthetic substrate among those that were tested.9 It is interesting to note that trocarin has a lower amidolytic activity on synthetic substrate S-2222, but a higher activity on a macromolecular substrate, prothrombin, in the absence of Ca 2+ ions than mammalian factor Xa (Table 1).

Kinetic Parameters for Hydrolysis of S-2222 by Trocarin and Factor Xa

Enzyme . الخامسالأعلى (Δabs/min/μg) . كم (mol/L) .
Trocarin 0.0055 2.5 × 10 −4
Bovine FXa 7.8 3.1 × 10 −4
Human FXa 4.5 4.0 × 10 −4
Enzyme . الخامسالأعلى (Δabs/min/μg) . كم (mol/L) .
Trocarin 0.0055 2.5 × 10 −4
Bovine FXa 7.8 3.1 × 10 −4
Human FXa 4.5 4.0 × 10 −4
Amino terminal sequencing of trocarin.

Amino terminal sequencing of the native protein yielded two parallel sequence signals of equivalent intensity, indicating that it consisted of two chains. These two sequences were highly homologous to the light and heavy chains of factor Xa. Upon reduction and pyridylethylation, the native protein yielded two chains: a light and a heavy chain 17 and 30 kD in mass, respectively. The individual chains were sequenced separately.

The light chain.

Amino-terminal sequencing of the light chain yielded the first 40 residues. Eleven residues at positions 6, 7, 14, 16, 18, 19, 25, 26, 29, 32, and 35 could not be identified. These positions correspond to those of Gla residues in factor Xa. Most of the sequence of the light chain was completed with peptides generated by a Lys C digest (Fig 4A). Seven Lys C peptides (Lc1-21, Lc22-36, Lc37-62, Lc63-79, Lc80-83, Lc84-101, and Lc102-137) covered the first 137 residues (Fig 5A). The C-terminal peptide, Lc128-151, and other overlapping peptides (Lc39-77, Lc78-82, Lc83-106, and Lc114-127) were obtained and sequenced from a Glu C digest (data not shown). Lysine was confirmed to be the C-terminal residue of the light chain, because it was the last residue sequenced on peptides, Lc129-141 and Lc128-141, generated by Asp N (data not shown) and Glu C, respectively (Fig 5A). The sequences of all peptides were unambiguously identified and their masses corroborate the sequence data (Table 3). In addition to the Gla residues, residue 52 could not be identified during sequencing, indicating that there may be some posttranslational modification at this location (see below).

RP-HPLC separation of peptides from Lys C digests of trocarin subunits. (A) LC-MS profile of peptides from light chain digest on a Hypersil BDS C18 column. Flow rate: 50 μL/min. (B) HPLC profile of peptides from heavy chain digest on a Jupiter C18 column. Flow rate: 1 mL/min. Peptides were eluted with a linear gradient of buffer B (80% ACN in 0.1% TFA).

RP-HPLC separation of peptides from Lys C digests of trocarin subunits. (A) LC-MS profile of peptides from light chain digest on a Hypersil BDS C18 column. Flow rate: 50 μL/min. (B) HPLC profile of peptides from heavy chain digest on a Jupiter C18 column. Flow rate: 1 mL/min. Peptides were eluted with a linear gradient of buffer B (80% ACN in 0.1% TFA).


شاهد الفيديو: هل صحيح بأنه سيموت جميع الملقحين ضد كورونا في غضون عامين د. بيترا خوري تكشف الحقيقة مع طوني خليفة (شهر فبراير 2023).