معلومة

لماذا يختلف 5S-rRNA عن الرنا الريباسي الأخرى بدلاً من نسخ واستخدام بوليميريز الحمض النووي الريبي؟

لماذا يختلف 5S-rRNA عن الرنا الريباسي الأخرى بدلاً من نسخ واستخدام بوليميريز الحمض النووي الريبي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

بينما يحدث نسخ الرنا الريباسي في النواة بوساطة RNA Polymerase-I ، نرى أن 5S-rRNA يتم نسخها في مكان آخر بواسطة RNA Polymerase-III. ما هو السبب ولماذا؟


إن بوليمرات الرنا الثلاثة (RNAPs) متشابهة جدًا مع بعضها البعض ، لكنها ليست متطابقة. كما هو موضح في هذه المقالة ، هناك وحدات فرعية خاصة بكل نوع من أنواع البوليميراز.

بالإضافة إلى توفير ركائز فريدة ترتبط بها الوحدات الفرعية الخاصة بالبوليميراز لإعطاء كل من RNAPs وظائفها المحددة ، فإن أكبر وحدتين فرعيتين تشكلان أيضًا شق الموقع النشط للأنزيمات حيث يحدث تفاعل النسخ.

تدعي نتائج المقالة المرتبطة أيضًا أنه على الرغم من أن الحلقات المشقوقة هي مناطق محفوظة ، إلا أن هناك اختلافات كبيرة في الطول بين البوليميرات الثلاثة.

كما أن جين الرنا الريباسي مشابه لجينات الرنا الريباسي وهي تختلف عن الجينات الأخرى في توظيف البوليميرات. توجد المحفزات "التقليدية" في بداية موقع البدء ، بينما تحتوي جينات 5s rRNA و tRNA على صندوق واحد ومربعين على التوالي يجندان RNAPIII.

الجينات 5s rRNA و tRNA لها محفزات داخل منطقة ترميز الجين.

المصدر: http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Gene_Structure5C-Eukaryotic_Promoter_Structure_for_RNA_Polymerase_III.htm

إليكم صورتان من الصفحة المرتبطة:

يحرر:

في هذه المقالة ، تم وصف أن جينات RNA 5s قد نقلت أوقاتًا صعبة خلال التطور ، ويمكن أن تكون آليات ذلك مماثلة للفئة الثانية من عناصر SINE ، التي تحتوي على معززات RNAP III الداخلية ، وهي مشتقة من الحمض الريبي النووي النقال (هذا يمكن تشير أيضًا إلى البنية المماثلة لجينات الحمض الريبي النووي النقال).

من هذا الاستعراض الجيد ، تطور بوليمرات الحمض النووي الريبي متعددة الوحدات الفرعية في مجالات الحياة الثلاثة ، أود أن أقتبس اقتباسًا قصيرًا قد يساعد في:

... يتم الحفاظ على بنية ووظيفة بعض هذه العوامل عبر المجالات الثلاثة ، بينما تُظهر بعض العوامل غير المتماثلة مستوى مثيرًا للاهتمام من التشابه الهيكلي والوظيفي ، مما يشير إلى أن التطور المتقارب قد أدى إلى وسائل بديلة لتسهيل نفس العملية.


تقترح هذه المقالة أن RNA Pol III تشكل في وقت مبكر من تطور حقيقيات النوى ، وبينما يوجد الكثير من الحفظ ، فإن الوحدات الفرعية الخاصة بالإنزيم تنتج عن تطور متباين. تشير مقالة أخرى إلى أن الزيادة الفعلية للوحدات الفرعية هي نتيجة التوظيف الدائم لعوامل النسخ في RNAP الأساسي من خلال دراسة تماثل الوحدات الفرعية مع TF الموجودة. لذا إذا كنت تسأل لماذا بوليميراز آخر؟ يقترح المقال أحداث الازدواج الجيني. هناك متماثلات لكل وحدة فرعية من RNAPII في العتائق ، والوحدات الفرعية الفريدة لـ RNAPI والثالث متماثلة مع عوامل النسخ لـ RNAPII (TF's المشار إليها TFII…). وخلصوا كذلك إلى أن ،

من المحتمل أن يكون حدث (أحداث) تكرار RNAP الأول قد أدى إلى اثنين من RNAPs: RNAPI و RNAPII الأجداد / RNAPIII. يتم دعم ذلك من خلال وجود ثلاثة بروتينات متماثلة موجودة في أنظمة النسخ RNAPII و RNAPIII ولكن بدون متماثلات في RNAPI. أول بروتينين هما TFIIE a و b الموجودان في RNAPII وهما متماثلان لـ RPC82 و RPC34 في RNAPIII ، على التوالي. في المقابل ، تفتقر RNAPI إلى تناظر أي من الوحدة الفرعية لـ TFIIE ، مما يشير إلى فقدان TFE في RNAP هذا. وبالتالي ، من المحتمل أن يكون TFE الأجداد قد فقد على طول سلالة RNAPI ولكن تم الحفاظ عليه في كل من RNAPII و RNAPIII بعد ازدواجية سلف RNAPII / RNAPIII. البروتين الثالث من هذا القبيل هو TFB الأثري ، وهو شائع لكل من RNAPII (حيث يُسمى TFIIB) و RNAPIII (حيث يُسمى TFIIIB-BRF) ولكنه غائب من RNAPI (الشكل 4). أدت أحداث التوظيف هذه إلى زيادة عدد وحدات RNAP الفرعية من 12 في RNAP أسلاف حقيقية النواة إلى 14 في RNAPI (Kuhn et al. 2007) و 16 في RNAPIII (17 إذا قمنا بتضمين البروتين RPC31 الخاص بالنبات والوحيد ؛ Proshkina وآخرون 2006).

لذلك في التخمين ، إذا كان عليك أن تسأل لماذا بوليميراز مختلف ، فإن تطور سلالتي RNAP يفرض فكرة ربط / بدء مختلفة لما قد يكون (رجعيًا) فيروسيًا أو (رجعيًا) عناصر قابلة للتحويل [الجينات tRNA و 5s rRNA ]. هذا لا يزال قيد التحقيق ، ومع ذلك.


مرحبًا بك في العالم الحي

- هنا ، أزواج الأدينين مع اليوراسيل بدلاً من الثايمين.

- ال يعتمد على الحمض النووي بوليميراز الحمض النووي الريبي يحفز البلمرة فقط في الاتجاه 5 & # 8217 & # 85943 & # 8217.

- 3 & # 8217 & # 85945 & # 8217 بمثابة ستراند قالب. تم بناء الحمض النووي الريبي من هذا.

- 5 & # 8217 & # 85943 & # 8217 بمثابة حبلا الترميز. يتم نسخ هذا إلى RNA.

3 & # 8217-ATGCATGCATGCATGCATGCATGC-5 & # 8217 قالب ستراند.

5 & ​​# 8217-TACGTACGTACGTACGTACGTACG-3 & # 8217 حبلا الترميز.

- أثناء النسخ ، لا يتم نسخ كلا الجدولين بسبب

& # 9702 يختلف كود البروتينات في كلا الخيوط. هذا يعقد الترجمة.

& # 9702 إذا 2 جزيئات RNA يتم إنتاجها في وقت واحد ، سيكون هذا مجامله لبعضهم البعض. يشكل أ مزدوج الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل ويمنع الترجمة.

وحدة النسخ

- هو جزء من الحمض النووي بين موقعي بدء النسخ وإنهائه. تتكون من 3 مناطق:

المروج: موقع ملزم لـ بوليميراز الحمض النووي الريبي. تقع في اتجاه 5'-end (المنبع).

الجين الهيكلي: المنطقة بين المروج والمنهي حيث يحدث النسخ.

فاصل: الموقع الذي يتوقف فيه النسخ. تقع في اتجاه 3'-end (downstream).

وحدة النسخ والجين

الجين هي وحدة وظيفية للوراثة. إنه ترميز تسلسل الحمض النووي لـ RNA (mRNA أو rRNA أو tRNA).

سيسترون هو جزء من ترميز الحمض النووي لـ بولي ببتيد أثناء تخليق البروتين. إنه أكبر عنصر في الجين.

يتكون الجين البنيوي في وحدة النسخ من نوعين:

> أحادي الجينات الهيكلية (الجينات المنقسمة) : يُرى في حقيقيات النوى. هنا ، تسلسل الترميز (exons أو متواليات معبر عنها) تمت مقاطعته بواسطة الإنترونات (متواليات متداخلة).

تظهر Exons في mRNA المعالج.

لا تظهر الإنترونات في mRNA المعالج.

> Polycistronic الجينات الهيكلية : يُرى في بدائيات النوى. هنا ، لا توجد جينات منقسمه.

النسخ في بدائيات النوى

في البكتيريا (بدائيات النوى) ، يتم تحفيز تخليق جميع أنواع الحمض النووي الريبي بواسطة واحد بوليميراز الحمض النووي الريبي. تتكون من 3 خطوات:

> المبادرة: هنا الانزيم بوليميراز الحمض النووي الريبييرتبط في موقع المروج للحمض النووي. هذا يسبب التفكك المحلي للحلزون المزدوج للحمض النووي. ان عامل البدء ( σ عامل) موجودة في بوليميراز الحمض النووي الريبي يبدأ تخليق الحمض النووي الريبي.

> استطالة: يتم تصنيع سلسلة RNA في الاتجاه 5 & # 8217-3 & # 8217. في هذه العملية ، يتم تفعيلها ثلاثي الفوسفات الريبونوكليوزيد تمت إضافة (ATP و GTP و UTP و amp CTP). هذا مكمل للتسلسل الأساسي في قالب DNA.

> نهاية: أ عامل الإنهاء ( ρ عامل) يرتبط ب بوليميراز الحمض النووي الريبي وينهي النسخ.

النسخ في البكتيريا

في البكتيريا ، يمكن أن يقترن النسخ والترجمة (تبدأ الترجمة قبل نسخ الرنا المرسال بالكامل) لأن

& # 183 mRNA لا يتطلب أي معالجة لتصبح نشطة.

& # 183 يتم النسخ والترجمة في نفس الحجرة (لا يوجد فصل بين العصارة الخلوية والنواة).

النسخ في حقيقيات النوى

في حقيقيات النوى ، هناك تعقيدان إضافيان:

1. هناك 3 بوليميرات RNA:

· بوليميراز الحمض النووي الريبي I: نسخ rRNAs (28S ، 18S و 5.8S أمبير).

· بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني: ينسخ الحمض النووي الريبي غير المتجانس (hnRNA). إنه مقدمة mRNA.

· بوليميراز الحمض النووي الريبي الثالث: ينسخ الحمض الريبي النووي النقال ، الرنا الريباسي 5S و snRNAs (الحمض النووي الريبي الصغير).

2. النصوص الأولية (hnRNA) تحتوي على exons و introns وهي غير وظيفية. ومن ثم يجب إزالة الإنترونات. لهذا ، فإنه يخضع للعمليات التالية:

· الربط: من hnRNA ، تتم إزالة الإنترونات (بواسطة spliceosome) ويتم تقطيع (ربط) exons معًا.

· السد: هنا ، نوكليوتيد ميثيل جوانوزين ثلاثي الفوسفات (غطاء) يضاف إلى 5 & # 8217 نهاية hnRNA.

· المخلفات (عديد الأدينيل): هنا، مخلفات أدينيلات (200-300) تضاف في 3 & # 8217 نهاية.


مقدمة

الريبوسوم ، الجهاز الأساسي للترجمة ، بلغة الإشريكية القولونية يتكون من ثلاثة أنواع من الرنا الريباسي (16S و 23S و 5S rRNAs) وما مجموعه 55 نوعًا من بروتين الريبوسوم. يلعب الرنا الريباسي أدوارًا أساسية كمكونات هيكلية ووظيفية للريبوسوم. جينوم ه. القولونية يحتوي على سبعة عوامل rRNA ، كل منها يتكون من 16S و 23 S و 5S rRNA بهذا الترتيب. تحتوي جميع أوبرات الرنا الريباسي السبعة ، إلى جانب جينات الرنا الريباسي الثلاثة ، جينات الرنا الريباسي المحددة داخل الفاصل بين جينات الرنا الريباسي 16S و 23S وبعد جين الرنا الريباسي 23S. تسلسل الجينوم الكامل لـ ه. القولونية تم تحديده لأول مرة لسلالتين من نوع K-12 ، MG1655 [1] و W3110 [2]. كلاهما يحتوي على نفس المجموعات السبع من rrn عوامل ، ولكن بسبب انعكاس جزء طويل يبلغ طوله حوالي 783 كيلو بايت في جينوم W3110 [3] ، فإن محاذاة سبعة rrn الأوبرا مختلفة بين اثنين جيد التوصيف ه. القولونية جينومات K-12 (الشكل 1A انظر أيضًا S1 الشكل). ترتبط مستويات بوليميراز الحمض النووي الريبي (الجهاز الأساسي للنسخ) والريبوسومات (الآلية الأساسية للترجمة) بمعدل نمو البكتيريا [4-12]. وجود سبعة أوبرا من الرنا الريباسي في ه. القولونية قد تكون هناك حاجة للتكيف الأمثل مع تغير الظروف الفسيولوجية [13 ، 14]. بعد مناهج منهجية في صنع ه. القولونية سلالات مع حذف أوبرات الرنا الريباسي [13،15] ، وجد أن مستوى انخفاض النمو يرتبط تقريبًا بالعدد المحذوف لأوبونات الرنا الريباسي. ومع ذلك ، فإن وجود عامل rRNA واحد على الجينوم قادر على إنتاج ما يصل إلى 56٪ من مستويات الرنا الريباسي البرية من النوع المفترض من خلال التعبير المحسن عن أوبر الرنا الريباسي المتبقي [15]. مستوى معين من الارتباط بين عدد rrn تم تأكيد عوامل التشغيل ومعدل نمو الخلايا أيضًا باستخدام مجموعة من المتغيرات الهندسية لعدد نسخ الرنا الريباسي [16]. كما أشارت هذه النتائج إلى أن ه. القولونية يؤوي مستوى مفرطًا من الريبوسومات ، مما يحافظ على مستوى كبير من تخزين الريبوسوم. في الواقع ، يتم تخزين الريبوسومات غير المستخدمة في أشكال غير نشطة عن طريق تكوين ثنائيات الريبوسوم بعد التفاعل مع عوامل ثنائية مثل عامل تعديل الريبوسوم RMF [17].

[كلاهما ه. القولونية سلالات K-12 3110 و K-12 MG1655 تحمل سبعة rrn الأوبرا ، لكن مواقعها على الجينوم تختلف في سلالتين بسبب انعكاس المسافة الطويلة في سلالة W3110 من خلال إعادة التركيب المتماثل بين rrnD و rrnE الأوبرا (انظر الشكل S1). [ب] التنظيم الجيني لكل منها rrn Operon هو نفسه بشكل أساسي بين سلالتي W3110 و MG1655 فيما عدا أن rrnD أوبرون W3110 يتوافق مع rrnE مشغل MG1655 و rrnE أوبرون W3110 يتوافق مع rrnD مشغل MG1655. [ج] سبعة rrn يمكن تصنيف الأوبرا إلى نوعين فيما يتعلق بجين (جينات) الحمض النووي الريبي داخل الفاصل بين جين 16S و 23S rRNA. في هذه الدراسة ، قمنا بتحليل جين riRNA داخل النوع A rrn أوبرا.

سبعة rrn يمكن تصنيف الأوبرا إلى مجموعتين. نوع أ rrn تشتمل الأوبونات على جين tRNA Glu داخل الفاصل بين الجينات بين جينات الرنا الريباسي 16S و 23S بينما النوع B rrn تحتوي الأوبرا على اثنين من جينات الحمض الريبي النووي النقال (tRNA Ile و tRNA Ala) (الشكل 1 ب). في حالة ه. القولونية تم استخدام K-12 W3110 في هذه الدراسة rrnB, rrnc, rrnD و rrnG الأوبرا تنتمي إلى النوع A بينما rrnA, rrnE و rrnH تنتمي الأوبرا إلى النوع B (الشكل 1 ب و 1 ج). في اتجاه مجرى جينات 23S RNA ، هناك جينات إضافية لـ tRNA في ثلاثة أوبرات rRNA ، أنا.ه., ثرف المصب من rrnD أوبرون و ASPU المصب من rrnH أوبرون و ASPT و trpT المصب من rrnc أوبرون. يبدو أن هذه الجينات الثلاثية الطرفية من الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) قد تم نسخها من مروجيها [18]. لتحقيق معدل نمو مرتفع ، ه. القولونية يزيد من معدل تخليق كل من الرنا الريباسي و الرنا الريباسي بطريقة منسقة. بعد تحديد قوة المروج ، تم العثور على سبعة أوبرا من الرنا الريباسي يتم التحكم فيها بشكل تفاضلي اعتمادًا على ظروف المغذيات ، مما يزيد من احتمال وجود أدوار تفاضلية غير محددة حتى الآن بين سبعة أوبرا رنا [19]. قد يُعزى التحكم التفاضلي في سبعة عوامل من الرنا الريباسي إلى الاختلاف في أنواع الحمض النووي الريبي في كل منها rrn أوبرون أو الأدوار الوظيفية المختلفة للرنا الريباسي [لاحظ أن حوالي 2٪ تسلسل من الرنا الريباسي يختلف بين سبعة أوبيرونات الرنا الريباسي (جدول S1)].

نسخ كل سبعة rrn يتم بدء عمليات التشغيل من المروجين الترادفي (المنبع القوي P1 والمصب P2 الضعيف) في منطقة التحكم المنبع لجين الرنا الريباسي 16S [20،21]. يلعب مروج P1 دورًا رئيسيًا في التعبير عالي المستوى لأوبرا الرنا الريباسي في الخلايا التي تنمو باطراد بينما يلعب P2 دورًا في التوليف المنخفض والقاعدية للرنا الريباسي. يخضع بدء النسخ من مروج P1 للتحكم الإيجابي بواسطة Fis [22-24] والتحكم السلبي بواسطة H-NS [25،26] ، يلعب كل من الأدوار المعمارية والتنظيمية في النواة ، واثنين من النيوكليوتيدات ، بدء ثلاثي فوسفات النوكليوزيد (iNTPs) [9،12،27،28] وإشارة تحكم صارمة ppGpp (و pppGpp) [8،9،29،30]. تتم معالجة النصوص الأولية أو الرنا الريباسي السلائف في وقت لاحق في الرنا الريباسي 16S الناضج ، الرنا الريباسي الفردي ، الرنا الريباسي 23S ، الرنا الريباسي 5S بواسطة مجموعة من نوكليازات المعالجة [31 ، 32].

في سياق رسم خرائط المحفزات التأسيسية التي تم التعرف عليها بواسطة RNA polymerase (RNAP) RpoD holoenzyme وحده في غياب عوامل النسخ الداعمة ، وجدنا ذروة قوية لربط الإنزيم المجسم لـ RpoD على جين 16S rRNA [33،34]. حددنا هنا موقع ربط holoenzyme RNAP RpoD داخل جين 16S rRNA لكل من السبعة rrn أوبرا. كمحاولة لتحديد الدور (الأدوار) الفسيولوجية لهذه المحفزات الداخلية داخل جينات الرنا الريباسي 16S ، قمنا بعد ذلك بتحليل الموقع الدقيق لهذا المروج الداخلي القوي داخل جين 16S rRNA في rrnD مشغل ه. القولونية K-12 W3110 ، والذي تم استخدامه كممثل للنوع A rrn أوبرون ، باستخدام مقايسة التحول الهلامي مع تحقيقات الحمض النووي المختلفة ومراقبة AFM. ثم تم فحص نشاط المروج من قبل أ في المختبر فحص النسخ و في الجسم الحي مراسل باستخدام المروج الداخلي داخل جين الرنا الريباسي 16S من rrnD أوبرون. أشارت النتائج تمامًا إلى أن هذا المروج الداخلي داخل جين 16S rRNA تم العثور عليه لتوجيه نسخ منطقة المباعد بين 16S و 23S rRNA ، مما يؤدي إلى توليد RNA داخلي ، المشار إليه في هذا التقرير. تم تأكيد توليف riRNA بشكل أكبر في الجسم الحي من خلال تحليل اللطخة الشمالية. نظرًا لأن نشاط مروج riRNA يزداد ، بالنسبة إلى المروجين الرئيسيين ، في المرحلة الثابتة ، فإننا نقترح إمكانية نسخ riRNA فقط عند النسخ من المروجين الرئيسيين لـ rrn تصبح الأوبرا صامتة ، مما يسمح بتوليف الحمض الريبي النووي النقال المباعد بشكل مستقل عن تخليق الرنا الريباسي.


يعتبر فيلامين الهيكل الخلوي A (FLNA) بروتينًا مهمًا يشارك في العمليات الخلوية المتعددة. أظهرت الدراسات السابقة أن FLNA يمكن أن تعزز أو تمنع نمو السرطان وتطوره ، ومع ذلك ، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الأحداث ليست مفهومة تمامًا. نوضح هنا أنه في كل من خلايا 293T و SaOS2 ، عززت ضربة قاضية لـ FLNA بشكل كبير نسخ الجينات المنقولة من RNA polymerase (pol) باستثناء مجموعة فرعية من جينات الحمض الريبي النووي النقال. في المقابل ، فإن إعادة التعبير عن FLNA في خط خلية سرطان الجلد الناقص في FLNA (A7) قمع النسخ لجميع الجينات المنقولة من pol III ، مما يشير إلى أن FLNA يمنع نسخ pol III بطريقة خاصة بنوع الخلية. كشفت فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين أن قمع نسخ الجين pol III بواسطة FLNA يرتبط بانخفاض شغل آلة نسخ RNA pol III عند المروجين. كشف الفحص المجهري المناعي ومقايسات الترسيب المناعي أن FLNA يمكن أن يرتبط بآلات نسخ RNA pol III من خلال مجال ربط الأكتين داخل النواة. كشف التحليل الميكانيكي أن FLNA يقمع نسخ الجينات pol III من خلال حصر توظيف آلية نسخ RNA pol III في مروجي الجينات الحساسة لتغيير تعبير FLNA. لا تعمل هذه النتائج على توسيع فهم وظيفة FLNA في الخلايا فحسب ، بل توفر أيضًا رؤى جديدة حول الآلية التي يقوم بها FLNA بقمع تكاثر الخلايا.

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين مشروع 31271395 (إلى دبليو دي) ومشروع أبحاث السرطان العالمي 09-0208 (إلى P. S.). يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.


نتائج

نوكلياز الحمض النووي الريبي الربط من هالوفيراكس فولكاني

هالوفيراكس فولكاني يشفر نوكلياز الحمض النووي الريبي (HVO_2952 ، النهاية) في أوبرا ثنائي الاتجاه مع تركيبة التربتوفانيل-الحمض الريبي النووي النقال (HVO_2951 ، trpS1) (الشكل 3) ، يتداخل الجينان بأربعة نيوكليوتيدات. كل من قاعدة بيانات التشغيل بدائية النواة (Taboada et al. ، 2012) والنسخة الخاصة بنا (Berkemer et al. ، 2020) و TSS (Babski et al. ، 2016) وبيانات موقع إنهاء النسخ (TTS) (Berkemer et al. ، 2020) تؤكد هذه المنظمة الجينومية. وفقًا لدراسات TSS الخاصة بنا (Babski et al. ، 2016) ، يبدو أن جين نوكلياز التضفير يحتوي على اثنين من محفزات المصب. trpS1 الجين (الشكل 3) ، وبالتالي فإن trpS1 يمكن نسخ الجين بشكل مستقل عن النهاية الجين. تظهر بيانات TSS أيضًا أن النسخ من ملف النهاية المروج منخفض نسبيا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النهاية لا يمكن اكتشاف mRNA في البقع الشمالية (البيانات غير معروضة). لكن بيانات البروتين تظهر بوضوح أن نوكلياز التضفير موجود في البروتين (Jevti & # x0107 et al. ، 2019 Schulze et al. ، 2020).

الشكل 3. الموقع الجينومي لـ النهاية تحليل موقع بدء الجينات والنسخ (TSS). ال النهاية يتم ترميز الجين على الشريط الناقص ويتداخل مع المصب trpS1 الجين بأربعة نيوكليوتيدات. تم إجراء تحليل dRNA-Seq لتحديد TSSs في H. volcanii (بابسكي وآخرون ، 2016). الإشارات الخضراء: تمت معالجة الحمض النووي الريبي المعزول باستخدام نوكلياز خارجي طرفي (+ TEX) ، وإشارات حمراء: لم تتم معالجة الحمض النووي الريبي باستخدام TEX (& # x2013TEX). سمحت لنا مقارنة القراءات من كلا الكسرين بتحديد TSSs. يظهر تسلسل الجينوم في المنتصف (مع الموقع الجينومي في النيوكليوتيدات ، تظهر الجينات المشروحة في أشرطة سوداء). تمثل المناطق الخضراء (+ TEX) والأحمر (& # x2013TEX) قراءات dRNA-Seq ، والارتفاع يتوافق مع التغطية (كما هو موضح على اليسار).

للتحقيق في الوظيفة البيولوجية للنوكلياز الداخلي للربط ، كنا نهدف إلى قمع تعبيره باستخدام تداخل CRISPR (CRISPRi) (Stachler and Marchfelder ، 2016 Stachler et al. ، 2019). يستخدم نهج CRISPRi نظام CRISPR-Cas الداخلي لقمع النسخ (Stachler and Marchfelder ، 2016 Stachler et al. ، 2019). يتم توجيه مجمع بروتين Cas Cascade بواسطة crRNA إلى منطقة المروج أو موقع بدء النسخ مما يؤدي إلى إعاقة بدء النسخ. إذا قمعنا بدء النسخ في النهاية المروج ، المروجين ل trpS1 وتقع في النهاية لا يزال الجين موجودًا وقادرًا على بدء نسخ trpS1 الجين.

ضربة قاضية لـ النهاية نتائج الجينات في عيوب النمو وعيوب في الربط tRNA

مواقع بدء النسخ من هالوفيراكس تم تحديدها في عمل سابق ، مما يسمح بتحديد مناطق المروج الموجودة في المنبع (Babski et al. ، 2016). لقد صممنا أربعة crRNAs لاستهداف المروج وموقع بدء النسخ وإطار القراءة المفتوح لـ النهاية الجين (الشكل 4 أ). ال هالوفيراكس تم تحويل السلالة HV30 بالبلازميدات التي تعبر عن هذه crRNAs (Stachler and Marchfelder ، 2016 Stachler et al. ، 2019) ، وتم تحليل المحولات الناتجة فيما يتعلق بسلوك نموها ، مما يدل على أن التعبير عن crRNA SEa2 كان له أقوى تأثير على النمو ( الشكل 4 ب والشكل التكميلي 2). أظهرت الخلايا التي تعبر عن هذا الحمض الريبي النووي الريبوزي عيبًا شديدًا في النمو. تم استخراج الحمض النووي الريبي من هذه الخلايا لتحديد مدى قوة النهاية تم قمع مرنا. منذ كمية النهاية كان mRNA الموجود في الخلية منخفضًا جدًا لاستخدام البقع الشمالية ، استخدمنا RT-PCR الكمي (qRT-PCR) لمقارنة تركيزات mRNA (الشكل 4C).

الشكل 4. CRISPRi ضد النهاية نتائج الجين في انخفاض النهاية تركيزات مرنا. (أ) موقع crRNAs. تم تصميم أربعة crRNAs مختلفة (SEa1-SEa4) ضد النهاية موقع بدء النسخ وبداية ORF. يشار إلى المروج بصندوق أحمر ويشار إلى موقع بدء النسخ TATA بـ +1 النهاية يشار إلى ORF باللون الأصفر ويتم عرض ATG أيضًا. TSS و A من ATG متطابقان ، مما يدل على أن النهاية mRNA هو بلا قيادة. للحصول على عرض أكثر تفصيلاً ، انظر الشكل التكميلي 1. (ب) يؤثر التعبير عن كرنا SEa2 على النمو. ينتج عن التعبير عن crRNA SEa2 مرحلة تأخر شديد (دوائر رمادية فاتحة ، SEa2). كعنصر تحكم ، تم التعبير عن كرنا الذي لا يربط أي هدف في الخلية (الماس الرمادي الداكن ، tele19). (ج) انقاص من النهاية تركيزات مرنا عند التعبير عن كرنا SEa2 تم إجراء qRT-PCR لقياس تركيزات النهاية مرنا في النوع البري (العمود pTA232 ، الخلايا HV30 & # x00D7 pTA232) وخلايا CRISPRi (العمود SEa2 ، الخلايا HV30 & # x00D7 pTA232SEa2). تم ضبط تركيز الرنا المرسال في الخلايا البرية على 100٪. يقلل القمع باستخدام CRISPRi تركيز الرنا المرسال إلى 1.1٪ (& # x00B10.5) من النوع البري.

التعبير عن كرنا SEa2 يقلل من النهاية انخفض تركيز mRNA إلى 1.1٪ (& # x00B10.5٪) من مستوى النوع البري في المرحلة الأسية. لتحديد تأثير التعبير السفلي عن النهاية على نضج intron الذي يحتوي على tRNAs ، تم إجراء البقع الشمالية للكشف عن سلائف tRNA Trp ومعالجة الوسطاء والشكل الناضج. أظهرت تحليلات اللطخة الشمالية بوضوح أن التعبير عن كرنا SEa2 يؤدي إلى تراكم الحمض الريبي النووي الريبي غير المقسم (الشكل 5).

الشكل 5. يتم إعاقة نضج الحمض النووي الريبي (tRNA) بشدة في خلايا CRISPRi. تم عزل الحمض النووي الريبي من خلايا التحكم (الممر c ، HV30 & # x00D7 pTA232) والخلايا التي تعبر عن crRNA SEa2 (الممر SEa2 ، HV30 & # x00D7 pTA232SEa2) (الممرات e: نمت الخلايا إلى الطور الأسي ، الممرات s: نمت الخلايا إلى ثابتة مرحلة). تم فصل الحمض النووي الريبي بنسبة 8 ٪ PAGE ونقله إلى أغشية النايلون. تم تهجين البقع باستخدام مسبار ضد intron الذي يكتشف أيضًا الحمض الريبي النووي النقال الناضج (اللوحة السفلية للوحة العلوية: تم تهجين نفس اللطخة بمسبار ضد الرنا الريباسي 5S). ينتج عن التعبير عن crRNA SEa2 تراكم الحمض الريبي النووي النقال غير المقسم ومعالجة الوسطاء. يمكن فقط اكتشاف كميات صغيرة جدًا من الحمض الريبي النووي النقال الناضج. يتم إعطاء علامة حجم الحمض النووي على اليسار. يتم عرض السلائف والمعالجة الوسيطة والمنتج الناضج بشكل تخطيطي على اليمين.

قمع نوكلياز الربط يغير الكميات النسبية من الحمض النووي الريبوزي (قبل)

السلائف الريبوسومية RNAs في H. volcanii تحتوي على اثنين من أشكال BHB (الشكل 6 أ). في الآونة الأخيرة ، تم إثبات أن السلامة الهيكلية لأشكال BHB هذه مطلوبة لتخليق وسيطة دائرية محددة قبل الرنا الريباسي و rRNA الناضج (J & # x00FCttner et al. ، 2020). يتم الحفاظ على وجود وهيكل هذا النموذج داخل سيقان معالجة الريبوسوم في معظم الأركيا التي تم تحليلها حتى الآن (J & # x00FCttner et al. ، 2020 Qi et al. ، 2020). التأثير على الوفرة النسبية الإجمالية لـ (قبل) الرنا الريباسي في النهاية تم فحص خلايا CRISPRi بواسطة qRT-PCR التي تجمع بين مجموعات مختلفة من الاشعال ، والتي أظهرت أن ما قبل الرنا الريباسي غير المشقوق في عزر BHB يتراكم قليلاً (الشكل 6 ب). بالإضافة إلى ذلك ، فإن كمية المواد الدائرية قبل الرنا الريباسي المشقوقة عادةً في شكل BHB وتعميمها بواسطة ligase تنخفض بشدة ، مما يدل على أن انقسام عزر BHB بواسطة نوكلياز الربط الداخلي (SE) ضعيف. علاوة على ذلك ، نتيجة النهاية القمع هو مقدار إجمالي مخفض من إجمالي 16S و 23S rRNAs في خلايا CRISPRi (الشكل 6). مجتمعة ، أثبتت هذه النتائج أن نوكلياز الربط ضروري لنضج الرنا الريباسي الفعال في الجسم الحي.

الشكل 6. تحليل نضج ما قبل الرنا الريباسي في الخلايا المستنفدة من نوكلياز الربط الداخلي للحمض النووي الريبي. (أ) تمثيل تخطيطي لـ H. volcanii مشغل rDNA. أحد مشغلي rDNA (المشغل A: HVO_3038-HVO_3042 والمناطق المرافقة) موجودان في H. volcanii ويتميز بشكل تخطيطي بجين tRNA Cys إضافي في نهايته 3 & # x2032. التكرارات المقلوبة التي تحيط بـ 16S / 23S rRNAs الناضجة تؤسس مناطق RNA مزدوجة تقطعت بهم السبل تحتوي على أشكال انتفاخ الحلزون (BHB) ، ركائز مفترضة للنوكلياز الداخلي للربط (SE ، مقص). مواد أولية مستخدمة للتحليل الكمي لـ RT-PCR لإجمالي 16 / 23S rRNAs (يظهر باللون البرتقالي) ، rRNAs 16S / 23S قبل التعميم (أنواع ما قبل الرنا الريباسي قبل انشقاق BHB ، أزرق) و 5 & # x2032 قبل 16S / 23S rRNAs التي تحتوي يشار إلى المناطق المنبع من الانتفاخ 5 & # x2032 (أنواع ما قبل الانقسام قبل BHB ، والأخضر) (الأسهم الخضراء). (ب) ملف تعريف نضج ما قبل الرنا الريباسي للخلايا المستنفدة من SE التي تم تحليلها بواسطة qRT-PCR.

ال trpS1 يتم التعبير عن الجين بشكل فردي

تظهر بيانات النسخ أن ملف trpS1 الجين المشفر المصب النهاية يتأثر بشكل طفيف فقط في النهاية سلالة CRISPRi وليست خاضعة للتنظيم السفلي ولكنها منظمة بشكل طفيف (التنظيم الأعلى 0.8 ، البيانات غير معروضة). وبالتالي ، فإن التنظيم السفلي للنسخ عند المروج المنبع النهاية لا يقمع التعبير عن TrpS1. مروجي trpS1 المكتشفة في النهاية يبدو أن الجين (الشكل 3) كافٍ لتعبير TrpS1 المناسب. للتحقيق في ما إذا كان النهاية و trpS1 يتم نسخها إلى مرنا ثنائي النواة ، أجرينا RT-PCR باستخدام بادئات تستهدف النهاية الجين و trpS1 الجين (الشكل 7 أ). تم العثور على mRNA ثنائي التكافؤ في الحمض النووي الريبي المأخوذ من الخلايا البرية ، ومع ذلك ، كانت كميات قليلة فقط من هذا الرنا المرسال موجودة في الحمض النووي الريبي من النهاية خلايا كريسبري (الشكل 7 ب).

الشكل 7. trpS1 يمكن نسخها بشكل مستقل عن النهاية. تم عزل الحمض النووي الريبي من خلايا التحكم (HV30 & # x00D7 pTA232 ، الممرات ج) والخلايا التي تعبر عن كرنا SEa2 (HV30 & # x00D7 pTA232SEa2 ، الممرات SEa2). تم نسخ RNAs عكسيًا باستخدام بادئات سداسية عشوائية. تم إجراء PCR باستخدام الاشعال التي تغطي المنطقة المتداخلة من النهاية و trpS1 (أ) أو جزء من trpS1 (ب). تم حل منتجات PCR على هلام الاغاروز 0.8٪. P: التضخيم من HV30 جدنا كعنصر تحكم PCR. N: التحكم بدون إضافة قالب DNA. M: 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم DNA ، مع إعطاء الأحجام على اليسار. تمت إضافة RT & # x2013 ، RNA المعزول لاستبعاد تلوث الحمض النووي RT + ، تمت إضافة قالب cDNA (من خلايا التحكم أو خلايا CRISPRi). الإشارات التي تقل عن 100 نقطة أساس في اللوحة B مشتقة من البادئات.

الحد من نتائج تعبير نوكلياز داخلية التضفير في التغييرات في النسخ

للتحقيق في تأثير قمع نوكلياز التضفير على الخلية ، قمنا بمقارنة النسخ من النوع البري و النهاية خلايا كريسبري. تم عزل الحمض النووي الريبي من ثلاث نسخ من كلتا السلالتين ، وتم إنشاء مكتبات (كدنا) وتعريضها لـ RNA-Seq (لمزيد من التفاصيل ، انظر المواد والطرق). تم التحقيق في بيانات التسلسل الناتجة ، واستخدم DESeq2 (Love et al. ، 2014) لاختبار الجينات المعبر عنها تفاضليًا في النهاية خلايا كريسبري بالمقارنة مع خلايا النوع البري. تم اختبار التعبير التفاضلي لجميع الجينات المشروحة لـ هالوفيراكس. إجمالاً ، تم العثور على 102 جينًا خاضعًا للتنظيم الأعلى و 41 خاضعًا للتنظيم المنخفض (عند عتبة السجل2: تم تطبيق 2 / & # x22122) (الجداول 1 و 2 والجداول التكميلية 1 ، 2).

الجدول 1. الجينات الخاضعة للتنظيم في النهاية سلالة كريسبري.

الجدول 2. الجينات التي تنظم في النهاية سلالة كريسبري.

تؤكد بيانات النسخ بوضوح التنظيم النازل للنوكلياز الداخلي التضفير ، لأنه الجين الأكثر تنظيمًا. تم أيضًا تنظيم جميع الحمض الريبي النووي الريبي الثلاثة المحتوي على intron (الجدول 1 والجدول التكميلي 1). بالإضافة إلى tRNAs المحتوية على intron ، تم أيضًا تنظيم سبعة أنواع أخرى من الحمض الريبي النووي الريبي (الجدول التكميلي 1). لم يتم تضمين الرنا الريباسي في التحليل لأن بروتوكول RNA-Seq الخاص بنا تضمن خطوة إزالة الرنا الريباسي.

تقوم جميع الحمض الريبي النووي النقال العشر الخاضع للتنظيم بفك تشفير أكواد mRNA المستخدمة بشكل تفضيلي وفقًا لتحيز الكودون المحدد لـ هالوفيراكس (ناكامورا وسوجيورا ، 2007) 4 ، والتي قد تؤدي مع انخفاض إنتاج الرنا الريباسي إلى انخفاض عام في تخليق البروتين. تضمنت الجينات الـ 31 الأخرى الخاضعة للتنظيم السفلي 17 جينًا ترميزًا للبروتينات والحمض النووي الريبي بوظيفة غير معروفة (الجدول التكميلي 1).

يشفر الجين الأكثر تنظيماً ترميز L-lactate. يتم ترميز هذا الجين في أوبرا ثنائية الاتجاه جنبًا إلى جنب مع الجين الخاص بـ oxidoreductase المعتمد على FAD (HVO_1697) ، والذي يتم أيضًا تنظيمه. توجد ستة من الجينات الأكثر تنظيمًا في مجموعة على pHV3 (HVO_B0042-HVO_B0047) وترتبط باستقلاب الحديد. إجمالاً ، تم تنظيم 11 بروتينًا مرتبطًا بالنقل و 22 جينًا ترميزًا للبروتينات والحمض النووي الريبي ذات الوظائف غير المعروفة (الجدول التكميلي 2).

RNAs الدائرية التي هي نتاج تفاعل SE

كنهج إضافي لتحديد جميع ركائز نوكلياز الربط الداخلي ، قمنا بإثراء وتسلسل الحمض النووي الريبي الدائري لـ H. volcanii (سيرنا- seq). يشق SE ركائزه في أشكال BHB ، ويتم تدوير الإنترون الناتج بواسطة ligase. وهكذا ، فإن سيرنا- seq يحدد من بين أمور أخرى ، منتجات التضفير الدائرية من SE. إجمالاً ، تم تحديد سبع دوائر دائرية تحيط بها فكرة BHB (الجدول 3). اثنان ينتميان إلى الحمض الريبي النووي النقال المعروف وأربعة إلى ركائز الرنا الريباسي SE المتوقعة واحدة تم تحديدها حديثًا. الإنترون الدائري للثالث tRNA ، tRNA Gln TTG، لم يتم العثور عليه ، والذي قد يكون بسبب طوله القصير (31 نيوكليوتيد). تم الإبلاغ سابقًا عن أن طريقة تسلسل الحمض النووي الريبي لها تحيز ضد الحمض النووي الريبي القصير (Danan et al. ، 2012). أظهرت تحليلات موقع intron في الركيزة المحددة حديثًا أنه يقع في 5 & # x2032 UTR لـ HVO_1309 (الشكل 8). تظهر أكواد HVO_1309 لببتيداز من بروتين عائلة M24 وبيانات النسخ أن HVO_1309 خاضع للتنظيم في النهاية خلايا CRISPRi (الجدول التكميلي 1). يشير هذا إلى أن الربط قد يكون مطلوبًا للتعبير الفعال أو استقرار الحمض النووي الريبي.

الجدول 3. التعميم RNAs التي حددتها CircRNA-seq.

الشكل 8. يوجد إنترون في 5 & # x2032 UTR من HVO_1309. حددت CircRNA-seq الحمض النووي الريبي الدائري الذي يحيط به نموذج BHB مشتق من 5 & # x2032UTR من جين HVO_1309. موضع الإنترون مظلل باللون الأصفر. يشار إلى TSS بخط أسود و +1. تم تحديد TSSs من خلال تحليل الحمض النووي الريبي المتسلسل (Babski et al. ، 2016). الأخضر: الحمض النووي الريبي المُعامل مع نوكلياز خارجي طرفي (+ TEX) ، أحمر: RNA لا يعالج بـ TEX (& # x2013TEX). يتوافق ارتفاع المناطق مع تغطية قراءات الحمض النووي الريبي المتسلسل (ترد قراءة الأرقام على اليسار). يشار إلى إحداثيات الجينوم في النيوكليوتيدات في الأسفل. يظهر الجين HVO_1309 على شكل شريط أسود.

عمليات نوكلياز الربط ما قبل 16S وركيزة mRNA التي تم تحديدها حديثًا في المختبر

ال هالوفيراكس يمكن التعبير عن نوكلياز التضفير في بكتريا قولونية وعمليات الحمض الريبي النووي الريبي المحتوية على intron بشكل فعال في المختبر (طومسون ودانيلز ، 1990). للتأكد من أن سلائف الحمض النووي الريبي الريباسي هي ركائز لـ SE ، قمنا بمعالجة سلائف الرنا الريباسي 16S المقطوعة في المختبر مع SE المؤتلف (الشكل 9). لتأكيد نشاط SE المؤتلف ، تم إجراء تفاعل تحكم مع intron الذي يحتوي على سلائف tRNA Trp التي أظهرت معالجة فعالة (البيانات غير معروضة). يبلغ طول سلف الرنا الريباسي 16S كامل الطول أكثر من 1600 نيوكليوتيد وهذه السلائف الطويلة هي ركائز دون المستوى الأمثل لـ في المختبر فحوصات المعالجة. لذلك ، أنشأنا ركيزة rRNA طويلة 568 nt ، والتي تم حذف معظم جزء الرنا الريباسي الناضج ، ولم يتبق سوى نهايات 5 & # x2032 و 3 & # x2032 من 16S rRNA وعزر BHB (الشكل 9 أ). أظهر الحضانة مع SE المؤتلف أن هذه الركيزة تمت معالجتها بالفعل بكفاءة (الشكل 9 ب). لاختبار ما إذا كان شكل BHB المحدد حديثًا الموجود في 5 & # x2032 UTR الخاص بـ HVO_1309 (الجدول 3) مشقوقًا بواسطة SE ، قمنا باحتضان السلائف المعنية في في المختبر الفحص باستخدام SE المؤتلف (الشكل 10) ، والذي أظهر أن هذه الركيزة تمت معالجتها. يمكن رؤية المنتجين المحيطين بسطح السفينة بشكل واضح (26 nt و 29 nt). الجزء المركزي (47 ​​nt) إما يعمل بشكل أبطأ ومرئيًا عند حوالي 65 نيوكليوتيد (جزء من هذا الحجم مرئي أيضًا في تفاعل التحكم) أو متدهور.

الشكل 9. في المختبر معالجة سلائف مقطوعة 16S. (أ) رسم تخطيطي لسلائف الرنا الريباسي 16S المقطوعة المستخدمة في في المختبر رد الفعل: تم حذف 1450 نيوكليوتيد من الجزء الداخلي من الرنا الريباسي 16S. Arrows and dashed lines indicate the SE splice sites and processing products. The resulting fragment sizes are given in nucleotides. (ب) في المختبر processing was performed with recombinant SE and the radioactively labeled substrate. Different amounts of SE protein were used (between 100 and 1,000 ng), as indicated at the top of the lanes. A DNA size marker is given on the left. The 568 nt long precursor is processed by the SE, resulting in three fragments: a 334 nt leader fragment, a 214 nt 16S rRNA loop fragment and a 20 nt trailer fragment. SE processing products can be observed beginning at 100 ng. Processing fragments are shown schematically on the right.

الشكل 10. في المختبر processing of the newly identified BHB containing RNA. (أ) Schematic drawing of the precursor substrate. As a substrate for the في المختبر processing reaction, the 5′ UTR of HVO_1309 was used, encompassing the intron flanked by the BHB motif with additional nucleotides up- and downstream. (ب) Processing reaction. The substrate was transcribed في المختبر and labeled throughout with [α−− 32 P]-UTP. في المختبر processing was performed with recombinant SE, and RNAs were separated by 8% PAGE. Samples were incubated for 60 min. A DNA size marker is given at the sides, and sizes are shown in the middle (M). A control reaction without enzyme was performed at the beginning and end of the reaction time (indicated as NC0 and NC60 for 0 and 60 min of incubation, respectively). Samples with enzyme were incubated for 60 min (SE). Left panel: short exposure, right panel: long exposure. The precursor RNA has a length of 102 nucleotides, and the processing fragments are 26, 29, and 47 nucleotides long. Substrate and processing products are shown schematically at the side.


التخليق الحيوي

في حقيقيات النوى

As the building-blocks for the organelle, production of rRNA is ultimately the rate-limiting step in the synthesis of a ribosome. In the nucleolus, rRNA is synthesized by RNA polymerase I using the specialty genes (rDNA) that encode for it, which are found repeatedly throughout the genome. The genes coding for 18S, 28S and 5.8S rRNA are located in the nucleolus organizer region and are transcribed into large precursor rRNA (pre-rRNA) molecules by RNA polymerase I. These pre-rRNA molecules are separated by external and internal spacer sequences and then methylated, which is key for later assembly and folding. After separation and release as individual molecules, assembly proteins bind to each naked rRNA strand and fold it into its functional form using cooperative assembly and progressive addition of more folding proteins as needed. The exact details of how the folding proteins bind to the rRNA and how correct folding is achieved remains unknown. The rRNA complexes are then further processed by reactions involving exo- and endo-nucleolytic cleavages guided by snoRNA (small nucleolar RNAs) in complex with proteins. As these complexes are compacted together to form a cohesive unit, interactions between rRNA and surrounding ribosomal proteins are constantly remodeled throughout assembly in order to provide stability and protect binding sites. This process is referred to as the "maturation" phase of the rRNA lifecycle. The modifications that occur during maturation of rRNA have been found to contribute directly to control of gene expression by providing physical regulation of translational access of tRNA and mRNA. Some studies have found that extensive methylation of various rRNA types is also necessary during this time to maintain ribosome stability.

The genes for 5S rRNA are located inside the nucleolus and are transcribed into pre-5S rRNA by RNA polymerase III. The pre-5S rRNA enters the nucleolus for processing and assembly with 28S and 5.8S rRNA to form the LSU. 18S rRNA forms the SSUs by combining with numerous ribosomal proteins. Once both subunits are assembled, they are individually exported into the cytoplasm to form the 80S unit and begin initiation of translation of mRNA.

Ribosomal RNA is non-coding and is never translated: rRNA is only transcribed from rDNA and then matured for use as a structural building block for ribosomes. rRNA is not translated into proteins of any kind. Transcribed rRNA is bound to ribosomal proteins to form the subunits of ribosomes and acts as the physical structure that pushes mRNA and tRNA through the ribosome to process and translate them.

Eukaryotic Regulation

Synthesis of rRNA is up-regulated and down-regulated to maintain homeostasis by a variety of processes and interactions:

  • The kinase AKT indirectly promotes synthesis of rRNA as RNA polymerase I is AKT-dependent.
  • Certain angiogenic ribonucleases, such as angiogenin (ANG), can translocate and accumulate in the nucleolus. When the concentration of ANG becomes too high, some studies have found that ANG can bind to the promoter region of rDNA and unnecessarily increase rRNA transcription. This can be damaging to the nucleolus and can even lead to unchecked transcription and cancer.
  • During times of cellular glucose restriction, AMP-activated protein kinase (AMPK) discourages metabolic processes that consume energy but are non-essential. As a result, it is capable of phosphorylating RNA polymerase I (at the Ser-635 site) in order to down-regulate rRNA synthesis by disrupting transcription initiation.
  • Impairment or removal of more than one pseudouridine or 29-O-methylation regions from the ribosome decoding center significantly reduces rate of rRNA transcription by reducing the rate of incorporation of new amino acids.
  • Formation of heterochromatin is essential to silencing rRNA transcription, without which ribosomal RNA is synthesized unchecked and greatly decreases the lifespan of the organism.

In Prokaryotes

Similar to eukaryotes, the production of rRNA is the rate-limiting step in the prokaryotic synthesis of a ribosome. في E. coli, it has been found that rRNA is transcribed from the two promoters P1 and P2 found within seven different rrn أوبرا. The P1 promoter is specifically responsible for regulating rRNA synthesis during moderate to high bacterial growth rates. Because the transcriptional activity of this promoter is directly proportional to the growth rate, it is primarily responsible for rRNA regulation. An increased rRNA concentration serves as a negative feedback mechanism to ribosome synthesis. High NTP concentration has been found to be required for efficient transcription of the rrn P1 promoters. They are thought to form stabilizing complexes with RNA polymerase and the promoters. In bacteria specifically, this association of high NTP concentration with increased rRNA synthesis provides a molecular explanation as to why ribosomal and thus protein synthesis is dependent on growth-rate. A low growth-rate yields lower rRNA / ribosomal synthesis rates while a higher growth rate yields a higher rRNA / ribosomal synthesis rate. This allows a cell to save energy or increase its metabolic activity dependent on its needs and available resources.

In prokaryotic cells, each rRNA gene or operon is transcribed into a single RNA precursor that includes 16S, 23S, 5S rRNA and tRNA sequences along with transcribed spacers. The RNA processing then begins before the transcription is complete. During processing reactions, the rRNAs and tRNAs are released as separate molecules.

Prokaryotic Regulation

Because of the vital role rRNA plays in the cell physiology of prokaryotes, there is much overlap in rRNA regulation mechanisms. At the transcriptional level, there are both positive and negative effectors of rRNA transcription that facilitate a cell's maintenance of homeostasis:

  • An UP element upstream of the rrn P1 promoter can bind a subunit of RNA polymerase, thus promoting transcription of rRNA. factors such as FIS bind upstream of the promoter and interact with RNA polymerase which facilitates transcription.
  • Anti-termination factors bind downstream of the rrn P2 promoter, preventing premature transcription termination.
  • Due to the stringent response, when the availability of amino acids is low, ppGpp (a negative effector) can inhibit transcription from both the P1 and P2 promoters.

Ribosome production

The ribosome is a large RNA–protein machine that synthesizes all cellular proteins. Ribosomes consist of two subunits: the small [small ribosomal subunit (SSU) 18S rRNA and 33 ribosomal proteins (RPs)] and large [large ribosomal subunit (LSU) the 28S, 5.8S and 5S rRNAs and 46 RPs] ribosomal subunits [1]. The 28S (25S in yeast), 18S and 5.8S rRNAs are co-transcribed by RNA polymerase I as part of a long single precursor (47S or 35S pre-rRNA in yeast). Ribosomes are assembled on the 47 S precursor transcript as it undergoes multiple processing and modification steps [1] (Figure 1A). RNA polymerase I transcription appears rate-limiting for ribosome production, whereas RPs are produced in significant excess with the unused proteins being rapidly degraded by the proteasome [2]. In contrast, the 5S rRNA is transcribed by RNA polymerase III and is incorporated into the 5S RNP (ribonucleoprotein particle), a ribosome assembly intermediate that also contains the RPs RPL5 and RPL11, before being integrated into the ribosome. Most of the steps of ribosome production occur in the nucleolus, a sub-compartment of the nucleus, with later steps taking place in the nucleoplasm and the cytoplasm [1] (Figure 1A).

Ribosome biogenesis and p53 signalling

(أ) Schematic representation of ribosome biogenesis and the link between the 5S RNP and MDM2. Three of the rRNAs (18S, 5.8S and 28S) are transcribed by RNA polymerase I (Pol I) in the nucleolus, whereas the 5S rRNA is transcribed by RNA polymerase III (Pol III) in the nucleoplasm. The mature (18S, 5.8S, 28S and 5S) rRNAs and the precursor rRNAs (47S, 21S, 18SE, 32S and 7S) are indicated. The LSU ribosome biogenesis factors PAK1IP1 and PICT1 are shown. (ب) Illustration of the 5S RNP interaction with MDM2 and the regulation of p53 signalling in both unstressed and stressed cells Ub: ubiquitin.

(أ) Schematic representation of ribosome biogenesis and the link between the 5S RNP and MDM2. Three of the rRNAs (18S, 5.8S and 28S) are transcribed by RNA polymerase I (Pol I) in the nucleolus, whereas the 5S rRNA is transcribed by RNA polymerase III (Pol III) in the nucleoplasm. The mature (18S, 5.8S, 28S and 5S) rRNAs and the precursor rRNAs (47S, 21S, 18SE, 32S and 7S) are indicated. The LSU ribosome biogenesis factors PAK1IP1 and PICT1 are shown. (ب) Illustration of the 5S RNP interaction with MDM2 and the regulation of p53 signalling in both unstressed and stressed cells Ub: ubiquitin.

Ribosome biogenesis is the major consumer of cellular energy that is up-regulated in cancer, with changes in nucleolar morphology being a hallmark of transformed cells, and down-regulated during cell division and differentiation [3]. Furthermore, ribosome biogenesis is affected by many, if not all, forms of cellular stress including DNA damage, oncogene overexpression (oncogenic stress), hypoxia, oxidative stress and nutritional stress [4]. Not surprisingly, ribosome production is also regulated by oncogenes such as c-myc and tumour suppressors such as p53, retinoblastoma protein (Rb) and p14ARF [4]. More recently, it has emerged that ribosome biogenesis also controls multiple cellular signalling pathways and defects in this process can lead to disease.


The importance of ribosome biogenesis in human health and disease

Changes in ribosome biogenesis have been linked to a wide range of conditions including cardiovascular, neurodegenerative and skeletal disorders as well as cancer [31–34]. An ever-growing number of rare genetic diseases, termed ribosomopathies, have been attributed to defects in ribosome production [35,36]. These diseases arise due to mutations in genes encoding RPs or proteins important for ribosome production. Common clinical manifestations include macrocytic anaemia, skeletal defects, skin problems and, notably, a pre-disposition to cancer. In many cases, p53 levels have been shown to be de-regulated and, in some animal models, the clinical symptoms of the diseases have been shown to be p53-dependent. Evidence suggests that defects in ribosome production in these cases lead to 5S RNP accumulation and subsequent p53 activation. The most-studied ribosomopathies are Diamond–Blackfan anaemia (DBA), Shwachman–Diamond syndrome (SDS), 5q syndrome and Treacher Collins syndrome (TCS). Where the mutant gene has been identified, the majority of DBA patients have mutations in genes encoding RPs including RPS19, RPS24, RPS17, RPS7, RPL35A, RPL5 and RPL11, and defects in pre-rRNA processing are commonly used as a diagnostic tool for this disease [37]. DBA patients present with hypoplastic macrocytic anaemia together with heterogeneous anomalies including skeletal, urogenital and cardiac defects. In DBA animal models some, but not all of the symptoms have been shown to be p53-dependent and the anaemia is dependent on the interaction between the 5S RNP and MDM2 [38]. Like DBA, 5q syndrome presents with macrocytic anaemia and is a form of myelodysplastic syndrome (MDS) [39]. 5q syndrome is caused by deletion of chromosome 5q, which contains the gene encoding RPS14. The anaemia in 5q syndrome has been attributed to haploinsufficiency of RPS14 and is p53-dependent in mouse models [40]. SDS is caused by mutations in the SBDS gene, which encodes a protein important for the late, cytoplasmic stages of LSU maturation [41]. SDS patients present with endocrine pancreatic insufficiency, ineffective haematopoiesis and, occasionally, anaemia and skeletal defects. Mutations in TCOF1, and less commonly the RNA polymerase I and III subunits POLR1C and POLR1D, cause TCS. TCOF1 is important for both the transcription and 2′-ا-methylation of the rRNA [34]. TCS presents with craniofacial anomalies due to proliferation defects of neural crest cells during early development. A mouse model successfully replicated the clinical phenotype by mutating the TCOF1 gene, and further work revealed the craniofacial defects to be p53-dependent [42].

For some time now, ribosome biogenesis has been known to be linked to cancer. Changes in nucleolar structure (as seen by Ag NOR staining) and an increase in ribosome production are two hallmarks of cellular transformation [4]. Strikingly, many anti-cancer chemotherapeutics, including actinomycin D and 5-fluorouracil, block ribosome biogenesis [43] making it a promising target for new cancer therapies [44]. The tumour suppressor p14 ARF , which needs the 5S RNP for its full capability to activate p53 [14], is also a suppressor of ribosome production [45]. However, the most striking link is seen with the highly abundant nucleolar protein nucleophosmin (NPM1), which is mutated in approximately 30% of leukaemias [46]. More recently, exome sequencing has revealed mutations in RPL5, RPL10, RPL11, RPL22, RPS15 and RPS20 in a variety of cancers but most notably leukaemias [47]. In particular, RPS15 mutations are associated with an aggressive, relapsed form of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) and frequently found associated with mutations in the p53 gene [48]. In many ribosomopathies, the patients are pre-disposed to multiple forms of cancer. For example DBA patients have a 5-fold higher risk of cancer than the general population with a 28- to 36-fold higher incidence of acute myeloid leukaemia (AML), osteosarcoma or colon cancer [47]. AML is the most common form of cancer associated with ribosomopathy patients. Solid tumours, such as head and neck tumours or osteosarcomas, are less common but also seen [49]. The increase in cancer rate in ribosomopathy patients appears counter-intuitive since they often have higher than normal levels of p53. However, it could be that the patient's cells become desensitized to p53 or that there is pressure to mutate or affect the p53 pathway when p53 levels are elevated.

Recent work has indicated a role for p53 in the regulation of cellular metabolism. This was highlighted in a mouse model carrying a cancer derived point mutation, C305F, in MDM2 [20]. This mutation blocks the 5S RNP–MDM2 interaction and renders the mouse cells insensitive to p53 activation when ribosome biogenesis is blocked using low levels of actinomycin D [23]. In addition, this mutation also increases the rate the mice develop c-myc-induced lymphomas. Interestingly, the MDM2–C305F mutation promotes fat accumulation in mice under normal conditions and hepatosteatosis under fasting conditions [20]. It was further shown that ribosome biogenesis, and the 5S RNP–MDM2 pathway, is the sensor responsible for p53-mediated remodelling of lipid homoeostasis in the liver in response to restricted nutrients. In a separate study, it was found that the protein nucleomethylin (NML) functions to repress rRNA transcription in the livers of mice fed a high-fat diet [50]. NML-null mice showed a reduced lipid accumulation in the liver and these mice did not become obese on a sustained high-fat diet. It is unclear whether NML-mediated suppression of rRNA transcription functions to control liver metabolism through p53, although it is likely that the livers in mice fed with a high-fat diet contain elevated levels of p53. It is therefore clear that the regulation of ribosome production is a major nutrient sensor and critical for the correct response to changes in diet that affect liver function.


From DNA to RNA The RNA world - PowerPoint PPT Presentation

يعد موقع PowerShow.com موقعًا رائدًا لمشاركة العروض التقديمية / عرض الشرائح. سواء كان تطبيقك يتعلق بالعمل ، أو الكيفية ، أو التعليم ، أو الطب ، أو المدرسة ، أو الكنيسة ، أو المبيعات ، أو التسويق ، أو التدريب عبر الإنترنت أو لمجرد التسلية ، فإن موقع PowerShow.com يعد مصدرًا رائعًا. والأفضل من ذلك كله ، أن معظم ميزاته الرائعة مجانية وسهلة الاستخدام.

يمكنك استخدام PowerShow.com للعثور على أمثلة على عروض PowerPoint التقديمية عبر الإنترنت وتنزيلها حول أي موضوع يمكنك تخيله حتى تتمكن من تعلم كيفية تحسين الشرائح والعروض التقديمية مجانًا. أو استخدمه للعثور على عروض تقديمية عالية الجودة لـ PowerPoint وتنزيلها مع شرائح مصورة أو متحركة ستعلمك كيفية القيام بشيء جديد ، مجانًا أيضًا. أو استخدمه لتحميل شرائح PowerPoint الخاصة بك حتى تتمكن من مشاركتها مع المعلمين أو الفصل أو الطلاب أو الرؤساء أو الموظفين أو العملاء أو المستثمرين المحتملين أو العالم. أو استخدمها لإنشاء عروض شرائح صور رائعة حقًا - مع انتقالات ثنائية وثلاثية الأبعاد ورسوم متحركة وخيارات الموسيقى التي يمكنك مشاركتها مع أصدقائك على Facebook أو دوائر Google+. هذا كله مجاني أيضًا!

مقابل رسوم رمزية ، يمكنك الحصول على أفضل خصوصية على الإنترنت في المجال أو الترويج للعروض التقديمية وعروض الشرائح مع أعلى التصنيفات. لكن بصرف النظر عن ذلك فهو مجاني. سنقوم بتحويل العروض التقديمية وعروض الشرائح إلى تنسيق الفلاش العالمي بكل مجدها الأصلي للوسائط المتعددة ، بما في ذلك الرسوم المتحركة ، وتأثيرات الانتقال ثنائية وثلاثية الأبعاد ، والموسيقى المضمنة أو أي صوت آخر ، أو حتى الفيديو المضمّن في الشرائح. كل هذا مجانا. يمكن مشاهدة معظم العروض التقديمية وعروض الشرائح على PowerShow.com مجانًا ، بل إن الكثير منها مجاني للتنزيل. (يمكنك اختيار ما إذا كنت ستسمح للأشخاص بتنزيل عروض PowerPoint التقديمية الأصلية وعروض شرائح الصور مقابل رسوم أو مجانًا أم لا على الإطلاق.) تحقق من PowerShow.com اليوم - مجانًا. حقا هناك شيء للجميع!

العروض التقديمية مجانًا. أو استخدمه للعثور على عروض تقديمية عالية الجودة لـ PowerPoint وتنزيلها مع شرائح مصورة أو متحركة ستعلمك كيفية القيام بشيء جديد ، مجانًا أيضًا. أو استخدمه لتحميل شرائح PowerPoint الخاصة بك حتى تتمكن من مشاركتها مع المعلمين أو الفصل أو الطلاب أو الرؤساء أو الموظفين أو العملاء أو المستثمرين المحتملين أو العالم. أو استخدمها لإنشاء عروض شرائح صور رائعة حقًا - مع انتقالات ثنائية وثلاثية الأبعاد ورسوم متحركة وخيارات الموسيقى التي يمكنك مشاركتها مع أصدقائك على Facebook أو دوائر Google+. هذا كله مجاني أيضًا!


Conclusions

The above data support the formation of multifaceted initiation complexes for executing co-transcriptional processing of tRNA in human cells (Fig. 2). But why it matters to coordinate and couple processing with transcription for biosynthesis of tRNA? The human genome has > 500 tRNA genes, the majority of which are mapped in six chromosomes [ [158] ]. More than half of these genes are arranged in repeats on chromosomes 1 and 6. The tRNA gene cluster in chromosome 6 resides in a genetic region that constitutes a transcription hotspot opposing the extended major histocompatibility class I locus [ [158] ]. Remarkably, the tRNA gene cluster in chromosome 1 is transcribed as individual short transcripts and not as long polycistronic transcripts [ [159] ]. Therefore, the arrangement of tRNA genes in the human genome is nonrandom and necessitates a tethering regulatory mechanism in the nucleus. In this regard, it has been shown that there are

2000 foci of Pol III in the nucleus of a dividing HeLa cell and that each focus has

5 active polymerases [ [99] ]. Since these polymerases are supposed to act through facilitated recycling mode (one gene–one committed polymerase), it is plausible that several tRNA genes be clustered and transcribed in a focus, in which enzymes tethered to each other by assembling massive transcription complexes [ [99] ], possibly like the one described in Fig. 2. A similar clustering of rRNA gene repeats positioned in distinct chromosomes takes place in nucleolar organizer regions that aid in coordinating transcription and processing of the new transcripts [ [160] ]. In the budding yeast, tRNA genes are not arranged in tandem repeats, but they do cluster in the nucleolus that hosts RNase P and Pol III [ [88, 89] ]. But can Pol III carry out co-transcriptional processing, as this polymerase lacks a motif similar to the CTD shown to enable Pol II to recruit processing factors? In fact, the presence of a domain such as the CTD is not a prerequisite for coordinated transcription and processing of all RNAs. Thus, Pol I, which lacks this domain, facilitates partial co-transcriptional cleavages of precursor rRNA in the nucleolus, as described above. Additionally, the length of a precursor transcript is not a limiting factor for having co-transcriptional processing at one or more sites. Two classes of short RNAs, small nuclear RNAs and small nucleolar RNAs, are transcribed by Pol II and processed via co-transcriptional cleavage at the 3′ and 5′ end, respectively [ [161-164] ]. Accordingly, co-transcriptional processing of tRNA is possible and it matters for having high enzyme specificity and productivity in order to supply the cell with large amounts of mature tRNAs needed for growth and proliferation.


شاهد الفيديو: Transcription DNA to mRNA (ديسمبر 2022).