معلومة

متى يجب استخدام البلازميد الصارم؟

متى يجب استخدام البلازميد الصارم؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كنت أتساءل عما إذا كان لدى أي شخص أمثلة جيدة حول متى تريد استخدام بلازميد صارم مقابل بلازميد مسترخٍ في بيئة بحثية.


المزايا الثلاث العامة هي:

  • تعبير أقل. إذا كان البلازميد الخاص بك يعبر عن شيء سام للخلايا بمستويات عالية ، فإن تقليل كمية الحمض النووي يمكن أن يقلل من التعبير.
  • انخفاض عبء البلازميد. إذا كنت قلقًا بشأن الإجهاد الناتج عن الاحتفاظ بالعديد من نسخ البلازميد ، فإن النسخ المنخفضة للبلازميدات مفيدة.
  • تجانس السكان. تميل البلازميدات المسترخية إلى التكاثر بحيث يكون هناك توزيع واسع لعدد نسخ / خلية بلازميد. وفي الوقت نفسه ، يقترن تكاثر البلازميد الصارم بإحكام بدورة الخلية نفسها ، وبالتالي فإن العدد يختلف بشكل أقل. في بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه التحكم في عدد البلازميدات في كل خلية.

ما هي الخلايا المختصة التي يجب أن أستخدمها لاستنساخ الحمض النووي كبير الحجم - (17 يناير 2006)

أريد استنساخ جين 3.8 كيلوبايت إلى متجه 4.1 كيلوبايت. أي نوع من الخلايا المختصة أفضل للاستنساخ بالحجم الكبير؟

مرحبًا Stormlina.
إن تفرقع إدخال 3.8 كيلو بايت في ناقل 4.1 كيلو بايت لا يجعله كبيرًا من البلازميد الذي يحتاج إلى أي نوع خاص من البكتيريا.
ما عليك سوى استخدام الخلايا المختصة المعتادة مثل DH5 alpha أو XL-1 الأزرق ويجب أن يكون كل شيء على ما يرام.

شكرا على الرد. لكنني حاولت عدة مرات ، ولم تنجح أبدًا.
أحصل دائمًا على شريط صغير غريب عند القطع لتأكيد النسخ. لذلك لست متأكدًا مما إذا كانت الخلايا المختصة نفسها ستقطع الإدخال عن طريق الصدفة.

إذا كنت تخشى أن تقطع خلاياك الإدخال ، فما هو الشكل الذي تريده؟ هل هو الحمض النووي بقدرات هيكلية غريبة أم الكثير من التتابعات المتكررة؟ في هذه الحالة ، أقترح عليك استخدام خلايا SURE أو Stbl.

بخلاف ذلك ، هل أنت متأكد من تسلسل المتجه و
الإدخال الخاص بك؟

هل يمكنك أيضًا إلقاء بعض الضوء على إستراتيجيتك في الاستنساخ ، فربما لا تكون الخلايا ولكن بعض الخطوات الأخرى التي تحدث بشكل خاطئ (قد تكون خلاياك ، ولكن من المعلومات التي نحصل عليها هنا ، لا يمكن لأحد أن يخبرنا بها).

أتفق مع pBluescript - استنساخ إدخال 3.8 كيلو بايت في متجه 4.1 كيلو بايت أمر روتيني ، ويجب ألا يتطلب أي خلايا مختصة خاصة. على سبيل المثال ، قمت مرة واحدة باستنساخ ملحق 17 كيلو بايت في pBluescript (لا تمزح & # 33) وتحويل DH5alpha دون مشاكل.

لذلك ، أشك في أن مشاكلك تنشأ من بحجم من الاستنساخ. ال المحتوى من الاستنساخ مسألة أخرى ، ومع ذلك.

زودنا ببعض المعلومات الإضافية (كما يوحي vairus) ، وسنرى ما إذا كان بإمكاننا طرح بعض الأفكار.

شكرا جزيلا لاقتراحك. في الحقيقة لقد طرحت السؤال من قبل ، والمشكلة كالتالي:
لقد حاولت استنساخ ملحق 3.8 كيلو بايت (pcr) إلى متجه 4.1 كيلو بايت ومتجه آخر بحجم 5.1 كيلو بايت. بالنسبة للمتجه الأول ، أستخدم Sal I للقيام بقطع فردي ، أما بالنسبة للناقل الثاني ، فأنا أستخدم XbaI. بالطبع ، أتعامل مع الإدخال بنفس الطريقة.
خطواتي هي:
1. قم بقص كل من المتجه وإدخاله ، وعادةً ما أقوم بقطع المتجه لمدة ساعة واحدة ثم إضافة CIP لمدة ساعة أخرى ، وفي بعض الأحيان حاولت وقتًا أطول للهضم.
2. قم بتشغيل الجل واستخراج الجل باستخدام Qiagen.
3. قم بالربط باستخدام Ligase T4 ، تكون نسبة الإدخال / المتجه عادةً 10. (عادةً ما أستخدم ناقل 15ng). في وقت ما أقوم بالربط نصف ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وبعض الوقت 14 درجة بين عشية وضحاها.
أنا أستخدم ناقل القطع فقط كعنصر تحكم.
4. التحول إلى DH5a خلايا مختصة محلية الصنع
في كل مرة ، يمكنني الحصول على الكثير من الحيوانات المستنسخة مقارنة بمجموعة التحكم. المشكلة هي عندما أقوم بإعدادات مصغرة وأقطع البلازميدات للتحقق منها ، فهي غير صحيحة & # 33 حاولت فحص إنزيم مختلف. وعادة ما ألتقط 10 نسخ من كل لوحة وواحدة من لوحة التحكم.

أتفق مع pBluescript - استنساخ إدخال 3.8 كيلو بايت في متجه 4.1 كيلو بايت أمر روتيني ، ويجب ألا يتطلب أي خلايا مختصة خاصة. على سبيل المثال ، قمت مرة واحدة باستنساخ ملحق 17 كيلو بايت في pBluescript (بلا مزاح & # 33) وتحويل DH5alpha دون مشاكل.

لذلك ، أشك في أن مشاكلك تنشأ من بحجم من الاستنساخ. ال المحتوى من الاستنساخ مسألة أخرى ، ومع ذلك.

زودنا ببعض المعلومات الإضافية (كما يوحي vairus) ، وسنرى ما إذا كان بإمكاننا طرح بعض الأفكار.

ربما ليست هذه هي المشكلة ولكن فقط في حالة حدوثها.
هل تحققت مما إذا كان الحمض النووي البلازميدي الذي تستخدمه قد تم تحضيره من سلالة الإشريكية القولونية التي تحتوي على جين السد؟ إذا لم يتم حذف هذه الجين من جينوم البكتيريا ، فستواجه مشكلة لأن البلازميد سيتم ميثليته ويكون إنزيم نوكلياز تقييد XbaI حساسًا لمثيلة السد.
ولكن يمكنك التحقق من ذلك بشكل تجريبي عن طريق تشغيل المتجه الفردي الذي تم هضمه باستخدام xbaI على مادة هلامية.

يجب ألا تكون هناك مشكلة في قطع منتج PCR ، لأنه لا يتم ميثليته.

احتمال آخر هو ضوء الأشعة فوق البنفسجية:
قبل قص شريط الإدخال من الجل ، يجب ألا تعرضه لضوء الأشعة فوق البنفسجية لالتقاط صورة له.
ضع الجل فوق لوح الزجاج بدلاً من وضعه مباشرة فوق شاشة الأشعة فوق البنفسجية.
في بعض الأحيان يكون ضوء الأشعة فوق البنفسجية قويًا جدًا ، مما يؤدي إلى إتلاف DNa وإصابة الاستنساخ اللاحق.

التقط صورة جل بدون الزجاج فقط بعد قص الشريط. لم يعد هناك شريط بعد الآن ، ولكن الصورة ستكون مجرد مرجع لتأكيد قطع الشريط الصحيح.

IMHO ، مع عدم وجود دليل يدعمها ، فقط المراقبة الشخصية المستمرة والمنتدى الحيوي ، Xba هي المشكلة.

آسف لا أستطيع أن أكون أكثر تحديدًا.

أيضًا ، هل لديك أي طريقة لضمان قطع منتج PCR الخاص بك؟ كم عدد القواعد الإضافية التي أدخلتها في البادئات بجوار مواقع التقييد؟ (أو هل قمت أولاً بالاستنساخ في topo؟).
راجع للشغل: هل تقوم أيضًا بتنقية منتج PCR الخاص بك بالهلام؟ إذا كان PCR الخاص بك يعطي نطاقًا واحدًا محددًا ، فأنا لا أرى سبب قيامك بذلك (أعلم أنه يمكنك بسهولة ربط الإدراج والمتجه المضاء بالأشعة فوق البنفسجية ، ولكن إذا لم يكن ذلك ضروريًا ، فلا تفعل ذلك ، فاستخدم تنقية العمود إن أمكن).


Labtutorials في علم الأحياء

تستخدم إنزيمات التقييد لقطع البلازميدات. لقد تناولنا البلازميدات في المحاضرة السابقة. يمكنك الحصول على وصف كامل عن إنزيمات التقييد هنا.

كمقدمة أساسية ، أود أن أقول إن إنزيمات التقييد هي إنزيمات للبكتيريا تمثل نوعًا من الوظيفة المناعية للبكتيريا. هم موجودون في أزواج في البكتيريا: DNA methylase وإنزيم التقييد. كلاهما يتعرف على نفس التسلسل. تقوم البكتيريا بميثلة الحمض النووي الخاص بها بطريقة تسلسلية محددة. وبهذا يكون الحمض النووي الخاص به محميًا ضد أي حمض نووي أجنبي. نظرًا لأن نقل الجينات الأفقي شائع جدًا في البكتيريا ، يمكن للخلية البكتيرية حماية مادتها الجينية بمساعدة إنزيمات التقييد. سيقدم الحمض النووي الغريب الذي يدخل الخلية نمط مثيلة مختلف للحمض النووي. سيتم قطع مواقع التعرف غير الميثيل بواسطة إنزيمات التقييد وبهذا يتم تدميرها.

الأنواع البكتيرية المختلفة لها إنزيمات تقييد مختلفة مع مواقع تمييز مختلفة (بالتأكيد لكل منها DNA methyltransferase أيضًا). تعكس تسمية إنزيم التقييد أصلهم. في أكثر الحالات تافهًا ، يخبرنا اسم إنزيم Eco RI أنه تم عزله من سلالة Escherichia coli R وأنه كان أول من تم عزله من هذه السلالة.

في معمل البيولوجيا الجزيئية نستخدمها لقطع ومعالجة البلازميدات. إنها مثل المقص الذي يمكن توجيهه إلى مواقع محددة في البلازميد لشقه. من خلال مجموعة مناسبة من إنزيمات القطع الخاصة بالموقع ، يمكننا الدخول في مجال مثير للغاية للهندسة الوراثية.

دعونا نلقي نظرة على بعض الاستخدامات الأساسية لأنزيمات التقييد:

يمكنك مشاهدة مقطع فيديو تمهيدي جيد هنا.

في أي حال عند العمل مع الإنزيمات ، يرجى استخدام قفازات اللاتكس ، والحفاظ على الإنزيمات على الجليد!

تمثل وحدة إنزيم التقييد & # 8220U & # 8221 كمية الإنزيم اللازمة لقطع 1 ميكروجرام من البلازميد في موقع قطع واحد ، في ساعة واحدة ، في بيئة مثالية.

يتم توفير بيئة التفاعل من خلال المخازن المؤقتة. عادة ما يتم توفير الإنزيمات بتركيز 10U / ul (10 وحدات لكل ميكروليتر). يتم توفير الإنزيمات في محلول glicerol ويتم تخزينها دائمًا عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

يتم إعداد تفاعل إنزيم التقييد النموذجي بالطريقة التالية:

1. تحقق من الخريطة من البلازميد لتوزيع مواقع القطع.

2. قياس التركيز من محلول البلازميد بواسطة مقياس الطيف الضوئي. يجب أن يكون تركيز البلازميد في حدود 1 ميكروجرام لكل ميكروليتر.

3. احسب حجم البلازميد المطلوب للحصول على الكمية المطلوبة من المنتج في النهاية. يجب أن يظل حجم التفاعل منخفضًا قدر الإمكان ، ويجب ألا يتجاوز 100 ميكرولتر / أنبوب التفاعل. استخدم أجهزة طرد مركزي دقيقة خالية من الدنا (كما تسمى) وأنابيب # 8220Eppendorf & # 8221.

4. خطة رد الفعل. يجب أن يكون لديك حوالي 1 إلى 10 وحدات من الإنزيم لكل ميكروجرام من البلازميد. في الحجم النهائي للتفاعل ، يجب أن يكون الحجم الإجمالي للإنزيم أقل من 1/10 ، لأن تركيز الجليسيرول الأعلى قد يغير خصوصية التفاعل. سيكون المخزن المؤقت 1/10 من الحجم النهائي. حافظ على الحجم النهائي منخفضًا (أقل من 100 ميكرولتر). إذا لزم الأمر ، اضبط حجم التفاعل على الحجم النهائي المخطط له باستخدام الماء الخالي من نوكلياز. تحقق من درجة الحرارة المثلى للتفاعل. عادة ما تكون 37 درجة مئوية ، لكنها قد تختلف. تحقق من نشاط النجم المحتمل للإنزيم في ورقة البيانات الخاصة به.

امزج المكونات التالية (UL تعني ميكروليتر):

16ul Nuclease Free Water +

1ul محلول بلازميد (تركيز 1ug / ul) +

2ul 10X عازلة +

إنزيم تقييد 1ul (10U / ul)

5.بمجرد التخطيط لرد الفعل ، بداية للقيام بذلك: أحضر الثلج ، أعد الأنابيب ، قم بإذابة المخزن المؤقت في يديك.

6. ماصة الكميات المطلوبة من الماء والبلازميد والعازل في الأنبوب.

7. أضف الإنزيم إلى الأنبوب ويخلط بلطف. لا دوامة!

8. ضع التفاعل في منظم الحرارة اضبط على درجة الحرارة المطلوبة.

9. ضع الإنزيم والعازل مرة أخرى إلى -20 درجة مئوية و تنظيف مقعدك!

10. بعد مرور الوقت المخصص ، وقف رد الفعل. عادة ما نحتفظ بالتفاعل في منظم الحرارة لمدة 4 ساعات. يمكنك إيقاف التفاعل بعدة طرق: عن طريق إضافة EDTA عن طريق الحرارة التي تعطل الإنزيم عند 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، أو ببساطة عن طريق تجميد الأنبوب وإبقائه مجمداً حتى تنقيته.


نتائج

معيار لصيانة البلازميد عن طريق الاقتران

استخدمنا نموذجًا حركيًا بسيطًا للتحقيق في مدى مساهمة HGT في صيانة البلازميد. يصف النموذج مجموعة واحدة (س) إما أن يحمل البلازميد (س 1) أو خالٍ من البلازميد (س 0) (الشكل 1 ب ، الطرق التكميلية ، المعادلات التكميلية (3) - (4)). على وجه الخصوص ، حددنا الظروف التي يسود فيها السكان الحاملون للبلازميد لتوفير تقدير متحفظ لكفاءة الاقتران الحرجة. بالنسبة للحالة المحدودة حيث يكون معدل فقد البلازميد صغيرًا نسبيًا (انظر الطرق التكميلية ، "اشتقاق معيار الاستقرار") ، استنتجنا كفاءة اقتران حرجة ( (< eta _ < rm Crit >> ) ، Eq. (1)) ، والذي يقارب الحد الأعلى لمقاومة البلازميد السائدة:

أين α يشير إلى التكلفة النسبية (α & GT 1) أو المنفعة (α & lt 1) للبلازميد ، κ هو ثابت معدل فقدان البلازميد ، و د هو معدل التخفيف من مجموعتي السكان. وبالتالي ، فإننا نستخدم مصطلح "الأنواع" للتمييز بين أي مجموعتين لهما تعريف فريد (< eta _ < rm Crit >> ) ، والذي يتطلب الحد الأدنى من الحيوانات المستنسخة البكتيرية المختلفة ذات الخلفيات المميزة وراثيًا (على سبيل المثال ، السلالات أو التصنيف أنواع متنوعة).

وفقًا لـ Eq. (1) ، سيتم الحفاظ على البلازميد طالما أن كفاءة الاقتران سريعة بدرجة كافية مقارنة بمعدل فقد البلازميد وعبء اللياقة (الشكل 1 ج ، د). تعد كفاءة الاقتران السريعة بشكل كافٍ ضرورية لكي تكون المجموعة الحاملة للبلازميد هي المهيمنة (س 1 و GT س 0 ، الشكل 1 ج) ، حتى عندما يكون البلازميد مفيدًا قليلاً (α قليلا & lt1). معيارنا مشابه للمعيار الذي اشتقه ستيوارت وليفين 17 ، ولكنه أكثر صرامة من حيث أنه يتطلب أيضًا هيمنة السكان الحاملين للبلازميد. كما أنه يتجنب التحديات التجريبية المرتبطة بفصل قياسات فقدان البلازميد عن تكلفة اللياقة 42. تجريبيا ، فقدان البلازميد الملحوظ (κ Obs) عن طريق قياس ثابت الوقت للانحلال لبلازميد غير قابل للتحويل ، والذي يمثل تأثيرًا مشتركًا لـ true κ و α (الشكل التكميلي 1 أ) 43. في الواقع ، يُظهر التحليل أن ( kappa _ < mathrm> تقريبا كابا ) للبلازميدات مع الحد الأدنى من تأثيرات اللياقة البدنية (α ≈ 1). نظرًا لأن هاتين المعلمتين يمثلان تحديًا للفصل ، فإن معيارنا يجمع تأثيرات α و κ سويا. لتحديد κ Obs، اخترنا استخدام بلازميد منخفض التكلفة (α = 1.02) لتقليل التأثيرات المربكة للتكلفة. استنادًا إلى معلماتنا المحددة تجريبياً ، يُظهر التحليل أن الخطأ المعياري المرتبط بملاءمة معدل فقد البلازميد (≈ 0.0022) أكبر من الفرق بين κ Obs و κ (انظر الطرق التكميلية ، "حسابات خسارة البلازميد" ، للاشتقاق الكامل).

الثبات بمساعدة الاقتران في نظام اصطناعي

لاختبار ما إذا كانت كفاءة الاقتران للبلازميدات الزوجية الشائعة سريعة بما يكفي لتعويض التكلفة ، اعتمدنا أولاً نظام اقتران اصطناعي مشتق من بلازميد F. في هذا النظام ، يتم ترميز آلية الاقتران على البلازميد المساعد Fالموارد البشريةالذي لا ينتقل من تلقاء نفسه 44. يمكن تعبئة البلازميد الثاني من خلال الاقتران عندما يحمل الأصل F لتسلسل النقل oriT. هنا ، نستخدم بلازميد قابل للتعبئة يرمز إلى K ، والذي يعبر عن YFP تحت سيطرة المروج التأسيسي القوي Pص، جين مقاومة كاناميسين (كان) (ك أ ن ص ) 44 و oriT. لتقدير تأثيرات الاقتران ، قمنا بتطبيق بلازميد مطابق لـ K إلا أنه لا يحمل oriT (K -) ، وبالتالي لا يمكن نقلها عن طريق الاقتران. تم إدخال النظام الاصطناعي في مشتق هندسي لـ الإشريكية القولونية MG1655 يعبر عن بروتين الفلورسنت الأزرق التأسيسي (BFP) كروموسومي ومقاومة الكربنيسيلين (كارب) (Amp R) 45 ، والمشار إليه ب (الشكل 2 أ). يمكن تمييز المجموعات الحاملة للبلازميد (B K ، B K−) عن السكان الخاليين من البلازميد (B 0) عن طريق الطلاء الانتقائي (باستخدام Carb + Kan) أو قياس التدفق الخلوي (باستخدام YFP) (الشكل التكميلي 2 أ). سيتم استخدام هذا الترميز لوصف جميع الأنواع ومجموعات البلازميد في جميع أنحاء النص (انظر الطرق التكميلية ، "التسمية").

يوفر هذا النظام تكوينًا تجريبيًا نظيفًا لتوضيح مساهمة الاقتران في صيانة البلازميد. يتيح K تقديرات معلمات أكثر دقة مقارنة بالبلازميدات الطبيعية ذاتية الانتقال. غالبًا ما تشفر البلازميدات الأصلية وظائف إضافية تعقد القياسات ، مثل وحدات الإدمان التي يمكن أن تؤدي إلى قتل الخلايا الوليدة بعد الفصل العنصري. الأهم من ذلك ، بدون بلازميد تحكم غير قابل للانتقال ، من الصعب فصل تأثيرات HGT عن العمليات الأخرى. بدلاً من ذلك ، يمكن تحديد مقدار فقد البلازميد وعبء اللياقة البدنية بدقة باستخدام K - ، مما يلغي التأثير المربك للاقتران. حيث oriT لم تؤثر بشكل كبير على عبء K مقارنة بـ K - (الشكل التكميلي 1B ، ص & gt 0.5 ، على الوجهين ر-test) ، يمكن أن تُعزى الاختلافات التي تنشأ في الديناميات العامة إلى الاقتران.

من قياساتنا لـ K ، نتوقع أن يكون الاقتران سريعًا بما يكفي لتمكين الصيانة في غياب اختيار المضادات الحيوية. على وجه الخصوص ، لدينا قياسات κ = 0.001 ساعة -1 (الشكل التكميلي 1 أ) ، α = 1.02 (الشكل التكميلي 1C) ، وافتراض د ≈ 0.05 ساعة −1 ، نقدر الكفاءة الحرجة (< eta _ < rm Crit >> = 0.002 ) h −1 لتكون أقل بكثير من تقدير كفاءة الاقتران من نمو المرحلة الأسية (< eta _ < rm C >> حوالي 0.01 ) h −1 34 (انظر الطرق ، "تقدير (< eta _ < rm Crit >> )"). في الواقع ، يمكن أن يغير فسيولوجيا الخلية بشكل كبير كفاءة الاقتران 34 ، حيث أن هذه القيمة أكبر بأربع مرات تقريبًا من الكفاءة المقاسة من الخلايا التي تم حصادها من المرحلة الثابتة (الجدول التكميلي 3).

لاختبار صيانة البلازميد بوساطة الاقتران ، قمنا بخلط B K و B 0 في كسور متساوية وزرعناها معًا. تم إجراء تخفيف قوي (10000 ×) كل 24 ساعة للحفاظ على النمو. تم استخدام تركيزات مختلفة من Kan (0 ، 0.5 ، و 2 ميكروغرام / مل) للتنوع α (1.02 ، 0.97 ، 0.42 ، على التوالي) (الشكل التكميلي 1C). كل بضعة أيام ، قمنا بتحديد كمية أجزاء الخلايا الحاملة للبلازميد (معبرة عن BFP و YFP) والخلايا الخالية من البلازميد (معبرة عن BFP فقط) باستخدام قياس التدفق الخلوي (انظر الشكل التكميلي 2 أ وقسم الأساليب "معايرة التدفق الخلوي" للحصول على تفاصيل المعايرة) .

في حالة عدم وجود الاقتران ، عندما يحمل البلازميد تكلفة (على سبيل المثال ، Kan = 0 و α & GT 1) تم القضاء على السكان الحاملة للبلازميد بعد أسبوعين (الشكل 2 ب ، النمذجة اليسرى والتجربة الصحيحة). وبالتالي ، بالنسبة للبلازميد المكلف غير القابل للنقل ، يؤدي التخلص من المضادات الحيوية إلى انعكاس المقاومة. إذا كان البلازميد مفيدًا بدرجة كافية ، يمكن أن يتعايش السكان الحاملون للبلازميد مع السكان الخاليين من البلازميد (الشكل 2 ب ، النمذجة اليسرى والتجربة الصحيحة). يعتمد جزء الخلايا الحاملة للبلازميد على الحجم النسبي لميزة النمو مقارنة بفقدان البلازميد. في المقابل ، إذا كان البلازميد قابلاً للنقل من خلال الاقتران ، حتى عندما يكون للبلازميد تكلفة ، فإن الخلايا الحاملة للبلازميد تهيمن على السكان في فترة زمنية قصيرة (الشكل 2 ج ، النمذجة اليسرى والتجربة الصحيحة). الحدس ، تقليل التكلفة أو زيادة المنفعة (أي تناقص α) يسهل الاستمرارية بمساعدة الاقتران ، وبالتالي يحدث استقرار البلازميد على مقياس زمني أسرع (الشكل 2 ج). بمجرد أن تكون فائدة البلازميد عالية بما فيه الكفاية (الشكل 2 ج) ، يستمر البلازميد بغض النظر عما إذا كان يمكنه الاقتران أم لا ، مما يشير إلى أن الاقتران لم يعد مطلوبًا للحفاظ على المقاومة.

الثبات بمساعدة الاقتران للبلازميدات المكلفة. لجميع نتائج النمذجة والتجريبية ، x-المحور أيام و ذ-المحور جزء من الخلايا. أ الاقتران الهندسي. سلالة الخلفية ، B ، تعبر عن BFP و Amp R بشكل أساسي 45. يحمل B البلازميد المساعد Fالموارد البشرية (ب 0) ، وهو غير قابل للانتقال ذاتيًا ، ولكن يمكنه تعبئة البلازميدات في الترانس. يحمل البلازميد المحمول K أصل النقل (oriT) ، وهو جين مقاوم للكاناميسين (Kan R) ، و yfp تحت سيطرة المروج التأسيسي القوي Pص 44. عندما يحمل B K ، يُشار إليه بـ B K. K بدون قابلية التحويل (أي بدون oriT) يُرمز إلى K - ، وعندما يحمله B ، B K−. ب ديناميات طويلة المدى بدون اقتران. يمثل اللون الأزرق الخلايا الحاملة للبلازميد والبرتقالية الخالية من البلازميد. تشير الخطوط المظللة إلى ظروف أولية مختلفة ناتجة عن تخفيف قوي تجريبيًا (

80 خلية / بئر ، 16 بئراً) ، أو تم اختيارها عشوائيًا من توزيع موحد (الكثافة الأولية الإجمالية التي تم الحفاظ عليها عند 1 × 10 −6 ، 20 مكررة). الخطوط الغامقة هي المتوسط ​​عبر جميع الظروف الأولية للون المقابل. النمذجة (يسار): الأول - الثالث هو α = 1.02 و 0.97 و 0.42 ، على التوالي ، مقدرة من القياسات التجريبية (الشكل التكميلي 1C). التجربة (على اليمين): i - iii هو Kan = 0 و 0.5 و 2 ميكروغرام / مل. يتم إجراء القياس الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حيث تكون الخطوط البرتقالية عبارة عن خلايا تعبر عن كل من BFP و YFP (B K−) ، والخط الأزرق عبارة عن خلايا تعبر عن BFP فقط (B 0). ج ديناميات طويلة المدى مع الاقتران. تم إجراء التجارب بشكل مماثل لـ (B) ، مع B K بدلاً من B K−. بدون المضادات الحيوية ، سيطر السكان الحاملون للبلازميد على الرغم من تكلفة البلازميد ، مما يدل على الثبات بمساعدة الاقتران. جميع معلمات النمذجة متطابقة باستثناء (< eta _ < rm C >> = 0.025 ) h −1. د تسعة بلازميدات اقتران تحملها الأنواع R (باستثناء C مع B 0 ، والتي تتصرف بشكل مشابه ، الشكل التكميلي 3D) تظهر الاستمرارية بمساعدة الاقتران. تم خلط R 0 بجزء متساوٍ مع R P (لعمومية البلازميد) وتم تخفيفه 10،000 × يوميًا. تم تقسيم CFU من أربعة إلى ستة لوحات مزدوجة الاختيار على العدد الإجمالي للمستعمرات التي تم حساب متوسطها عبر أربعة إلى ستة لوحات سم للقياس الكمي. تتكرر التجارب مرتين على الأقل. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للقياسات من أربعة إلى ستة. البلازميدات المستخدمة هي (i) # 168 ، (ii) # 193 ، (iii) R388 ، (iv) C ، (v) # 41 ، (vi) RP4 ، (vii) K ، (viii) PCU1 ، و (ix) ) R6K (انظر الجدولين التكميليين 1 و 3)

علاوة على ذلك ، يشير التحليل إلى أن الطفرات التعويضية ، حتى مع معدل طفرة عالية ، لم تساهم بشكل كبير في الديناميكيات الكلية (الشكل التكميلي 2 ب). نلاحظ أن نموذجنا يفترض ثابت معدل التخفيف (د) ، والذي يمثل تقريبًا للتخفيفات الدورية المنفصلة في تجاربنا. ولدت عمليات المحاكاة باستخدام نموذج تنفيذ التخفيفات المنفصلة نفس النتائج نوعيًا (الشكل التكميلي 1 د). أخيرًا ، أدخلنا ضوضاء في معدل الاقتران لكل مجموعة من الشروط الأولية مثل (< eta _ < rm C >> ) يمكن أن يغير مقدارًا صغيرًا من القيمة الأساسية ، في غضون 10 ٪ من المتوسط ​​، بما يتوافق مع clonal التباين 34. هذا التباين لا يغير النتائج النوعية (الشكل التكميلي 2C).

الثبات بمساعدة الاقتران للبلازميدات المتنوعة

لقد أوضحنا سابقًا أن كفاءة الاقتران للنظام الاصطناعي يمكن مقارنتها بكفاءة بلازميدات F الطبيعية والعديد من بلازميدات الاقتران الطبيعي الأخرى 34. لذلك ، نتوقع أن تظهر هذه البلازميدات أيضًا استمرارًا بمساعدة الاقتران. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتحديد ديناميكيات ثمانية بلازميدات اقتران إضافية ، تغطي ست مجموعات عدم توافق (incF ، incN ، incI ، incX ، incW ، incP) والتي تشمل & gt 70 ٪ من البلازميدات الكبيرة الأكثر شيوعًا المعزولة من المعوية (335 بلازميدات تبلغ 20 كيلو بايت من GenBank) 47 ، تغطي نطاقًا واسعًا من كفاءات الاقتران وتأثيرات اللياقة البدنية (الشكل التكميلي 3 أ ، ب) ، وتشمل ثلاثة بلازميدات مقترنة معزولة سريريًا ترميز طيفًا ممتدًا من-lactamases (ESBLs). تشتهر مسببات الأمراض المنتجة للـ ESBL بالاقتران بوساطة البلازميد 48،49،50 وهي ذات أهمية قصوى للصحة العالمية 51 ، 52. قمنا بنقل كل بلازميد فردي إلى سلالة خلفية مشتركة (بكتريا قولونية MG1655 مع dTomato المتكاملة كروموسومي ، ومقاومة الكلورامفينيكول (Cm) (Cm R) ، والمشار إليها بـ R) ، وقياس المعلمات ذات الصلة لتقدير (< eta _ < rm Crit >> ) تم تقدير كمية البلازميد C مع سلالة الخلفية B نظرًا لأن كلا من البلازميد C والسلالة R يعبران عن Cm R ، و B يتصرفان نوعيًا بشكل مشابه لـ R (الشكل التكميلي 3D).

تشير تقديراتنا إلى احتمال كبير للثبات ( left (<< mathrm < Delta >> n = < eta _ < rm C >> - < eta _ < rm Crit >> & gt0> right) ) لكل من البلازميدات التسعة (الشكل التكميلي 3C ، بما في ذلك RK للتحكم) ، إما لأنها مفيدة بدرجة كافية و / أو تنتقل بسرعة كافية. لاختبار ذلك ، قمنا بتنفيذ نفس تجارب المنافسة كما هو موضح سابقًا ، وقمنا بتحديد جزء من الخلايا الحاملة للبلازميد باستخدام وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) على ألواح مزدوجة المضادات الحيوية (انظر الطرق). تم إجراء التخفيفات اليومية لمدة 14-20 يومًا. في الواقع ، استمر كل بلازميد طوال مدة التجربة (الشكل 2 د). من المحتمل أن تكون صيانة أو هيمنة العديد من البلازميدات (# 168 ، # 193 ، RP4 ، R6K ، و R388) بسبب كونها محايدة أو مفيدة طفيفة (الشكل التكميلي 3C) ، بالإضافة إلى نقلها السريع. في المقابل ، تم الحفاظ على PCU1 على الرغم من تكلفته العالية جدًا (المقدرة α ≈ 3 ، الشكل 2 د ، انظر الشكل التكميلي 3E للمقياس اللوغاريتمي).

استمرار بمساعدة الاقتران في اتحادات أكثر تعقيدًا

عادةً ما تكون البيئات الطبيعية أكثر تعقيدًا بكثير ، وتتكون من أنواع متنوعة مترابطة من خلال شبكة معقدة من التبادل الجيني 6 ، 53. يمكن أن تكون هذه الشبكات بمثابة خزانات لمقاومة المضادات الحيوية فيما يسمى "النقاط الساخنة" HGT ، مما يتيح نشر المقاومة لمختلف مسببات الأمراض أو الميكروبات المتعايشة 54،55،56. لذلك ، تساءلنا عما إذا كان الاستمرارية بمساعدة الاقتران يمكن أن تحدث في مجتمع متعدد الأنواع. لم يتم استكشاف هذا السؤال بشكل قاطع من قبل.

تشير النمذجة إلى أنه طالما تم استيفاء معيار الاستقرار ، يمكن الحفاظ على بلازميد واحد عن طريق الاقتران بغض النظر عن عدد الأنواع الموجودة (الشكل 3 أ ، الطرق التكميلية ، المعادلات التكميلية (7) - (10)). لاختبار هذا ، قدمنا ​​ثانية بكتريا قولونية سلالة R مع أو بدون oriT (R K أو R K−) (الشكل التكميلي 4A). يتم قياس محتوى البلازميد الكلي كمجموع لجميع الأنواع الحاملة للبلازميد (R K + B K). تمشيا مع تنبؤاتنا ، تظهر النتائج أن الاقتران يمكّن من استدامة البلازميد مقارنة بالتحكم غير المقترن (الشكل 3 أ).

الثبات بمساعدة الاقتران مع أنواع و / أو بلازميدات متعددة. أج x-المحور أيام و ذ-المحور جزء من الخلايا. تمثل الخطوط الغامقة والمظللة متوسطًا عبر الظروف الأولية أو الفردية ، على التوالي. يشير اللون إلى اللون الأزرق لخلو البلازميد (س 0) ، والبرتقالي أو الأحمر للخلايا الحاملة للبلازميد (س 1) K أو C على التوالي. أ نوعان ، مجتمع واحد بلازميد. تركت لوحتان: لا يوجد اقتران صحيح لوحتين: مع الاقتران. س 0 = ب 0 + ص 0 و س 1 = ب ك + ص ك. النمذجة: من الأسفل (1) إلى الأعلى (3) α 1 = α = 1.02 و 0.97 و 0.42 على التوالي و α 2 = 1.03 و 1.02 و 0.9 (انظر المعادلات التكميلية (7) - (10) ، الشكل التكميلي 4 أ). جرب من الأسفل (i) إلى الأعلى (iii): Kan = 0 ، 0.5 ، و 2 ميكروغرام / مل ، على التوالي. ب ديناميات البلازميد عالية التكلفة. النمذجة (العمود الأيسر): من أسفل (1) إلى أعلى (3) α = 1.13 و 1.03 و 0.3 على التوالي (انظر المعادلات التكميلية (3) - (4) ، الشكل التكميلي 4 ب). التجربة (العمود الأيمن): من الأسفل (i) إلى الأعلى (iii): Cm = 0 ، 0.5 ، و 2 ميكروغرام / مل. ج نوع واحد مجتمع ثنائي البلازميد. يمثل كل صف مجموعة مختلفة من α، معدّل بدون مضاد حيوي (i) ، Kan (ii-iii) ، أو Cm (iv-v). يمكن أن تحمل الأنواع اثنين (س 11) واحد (س 10 , س 01) ، أو بدون بلازميدات (س 00). النمذجة (العمودين الأول والثالث): من الأسفل (i) إلى الأعلى (v) α 3 = 1.3 ، 1.2 ، 0.42 ، 1.01 ، 0.35 (انظر المعادلات التكميلية (11) - (14) ، الشكل التكميلي 4 ب). التجربة: (العمود الثاني والرابع مثل ذلك س 1 = B K + B CK أو س 1 = B C + B CK لـ K أو C على التوالي). يخلط ب ج بالتساوي مع ب ك. د, ه ثلاثة أنواع ، مجتمع ثلاثي البلازميد. الأنواع (R و Y و B) متألقة بشكل فريد (معبرة عن dTomato أو YFP أو BFP ، على التوالي) والبلازميدات (R6K و RP4 و R388 وعلامات الماس والمربع والدائرة ، على التوالي) لها علامات مقاومة مميزة (Strp R و Kan R و Tm R على التوالي). يتوافق لون التظليل مع جزء السكان المعني (يسار ذ-محور) ، وتشير العلامات إلى جزء من كل بلازميد (يمين ذ-محور). يتكون التكوين التجريبي الأولي من R 0 و R R6K و Y 0 و Y R388 و B 0 و B RP4. النمذجة (يسار): الظروف الأولية العشوائية مثل الحفاظ على مجموع السكان الخالية من البلازميد عند 1 × 10 −4 , والسكان البلازميد تم اختيارهم بشكل تعسفي بين 1 × 10 –5 و 1 × 10 6 ، بما يتوافق مع البيانات (الجدول التكميلي 2 لتقديرات المعلمات). التجربة (على اليمين): تشير أشرطة الخطأ إلى المتوسط ​​عبر أربعة إلى ستة لوحات مكررة ، وتتكرر خمس مرات

علاوة على ذلك ، تتنبأ النمذجة بحدوث استمرار بمساعدة الاقتران لنوع واحد يحمل بلازميدات اقتران متعددة. هذا يتوقف على قدرة البلازميدات على الوجود بشكل مستقل عن بعضها البعض (على سبيل المثال ، مجموعات عدم التوافق المتميزة لضمان آلية النسخ المتوافقة وغياب الاستبعاد السطحي الذي يمنع دخول أحد البلازميدات) ، وحقيقة أن المعلمات البلازميدية الأخرى ذات الصلة ( على سبيل المثال ، (< eta _ < rm C >> ) ، α، أو κ) بشكل جذري بسبب وجود بلازميد آخر (الطرق التكميلية ، المعادلات التكميلية (11) - (14)). لاختبار هذه الفكرة ، قمنا بتطبيق مجتمع اقتران ثنائي الاتجاه عن طريق خلط B يحمل إما K أو بلازميد متحرك آخر C. C يعبر عن mCherry ، Cm R ، وهو متوافق مع K (أصول النسخ المتماثل p15A و ​​pSC101 ، على التوالي). بشكل مستقل ، نظرًا لأن تكلفة C أكبر مقارنةً بـ K (الشكل التكميلي 3B) ، فقد تطلب الاقتران نطاقًا زمنيًا أطول للتغلب على المنافسة واستمرارها بثبات (الشكل 3 ب). معًا ، كانت ديناميكيات كل بلازميد على حدة متطابقة مع ديناميكيات السكان أحادية البلازميد ، بغض النظر عن كيفية تعديلنا α (الشكل 3 ج ، لا يوجد مضاد حيوي ، Kan ، و Cm انظر الشكل التكميلي 4A ، B لـ α التقديرات).

تشير هذه النتائج إلى أنه على الرغم من التعقيد الظاهر ، فإن مصير البلازميد في مجتمع يتكون من (ن) الأنواع و (ص) البلازميدات (تؤدي إلى ن2 ص السكان) من ديناميات البلازميد الفردية ، إذا كانت هذه البلازميدات لا تتداخل مع بعضها البعض. يخضع مصير كل بلازميد لمعيار الاستمرارية بمساعدة الاقتران (على سبيل المثال ، (< eta _ < rm C >> & gt < eta _ < rm Crit >> )). إذا كان (< eta _ < rm C >> & gt < eta _ < rm Crit >> ) لزوج واحد على الأقل ، سيستمر البلازميد إذا كان المضيف (المضيفات) المعين يمكن أن يتعايش ضمن المجموعة لفترة طويلة المصطلح (الذي تحركه اللياقة البدنية إلى حد كبير). الأهم من ذلك ، أن الأنواع التي تتعايش يجب أن تكتسب البلازميد ، إما في التركيبة السكانية الأولية ، أو عن طريق الاقتران. ينتج عن هذا حاجز أولي للبلازميد لتأسيس نفسه بسبب المنافسة ، مما يؤدي إلى الاعتماد على التكوين الأولي في تحديد مصير البلازميد (انظر الطرق التكميلية ، "نموذج ثلاثة أنواع من البلازميدات").

لاختبار ذلك ، قمنا ببناء مجتمع يتكون من ثلاثة أنواع (بكتريا قولونية سلالات تدل على B 0 و R 0 و Y 0) تنقل ثلاثة بلازميدات متوافقة بشكل متبادل (الشكل التكميلي 5 أ ، الطرق التكميلية ، المعادلة التكميلية (16) ، الجدول التكميلي 4). بدأ كل بلازميد في نوع واحد ، على التوالي (RP4 و R6K و R388 ، يرمز لهما 1 و 2 و 3 في الشكل ثلاثي الأبعاد ، الشكل التكميلي 5 أ). تم اختيار هذه البلازميدات الثلاثة على وجه الخصوص لأنها تنتمي إلى مجموعات عدم توافق متميزة (X و P و W) ، ويمكن تمييزها باستخدام اختيار المضادات الحيوية (Streptomycin (Strep) و Kan و Trimethoprim (Tm) ، على التوالي ، الجدول التكميلي 3). نظرًا لأن جميع الأنواع تعبر عن الكروموسومات Cm R ، فقد استخدمنا الطلاء الانتقائي لتحديد جزء البلازميد وقياس التدفق الخلوي لتحديد تكوين الأنواع. في هذا السيناريو ، على الرغم من أن البلازميدات تبدو بشكل فردي مفيدة لمضيفها (α & lt 1) ، فإنها تعرض تكلفة مقارنة بأنواع أخرى / زوج بلازميد (على سبيل المثال ، قارن B RP4 بـ R R388 ، الشكل التكميلي 5B). بناءً على تقديراتنا السابقة ، نتوقع استمرار الثبات لجميع البلازميدات الثلاثة في هذا المجتمع. في الواقع ، تظهر النتائج أن كل بلازميد فردي أظهر ثباتًا طوال مدة التجربة ، لمدة تصل إلى أسبوعين (الشكل 3 هـ). في حالة عدم وجود اقتران (R 0 و B 0 و Y 0 فقط) ، فإن التنافس بين الأنواع الثلاثة يفضل السكان الأصلح (Y 0) ، مما يثبط نمو كل من R 0 و B 0 (الشكل التكميلي 5 ب).

عكس صمود المقاومة بمساعدة الاقتران

تظهر نتائجنا أن البلازميدات الزوجية المتنوعة يتم نقلها بالفعل بسرعة كافية لتمكين استدامة البلازميد. وفقًا لمعيار الوجود (مكافئ (1)) ، يمكن تحقيق انعكاس المقاومة عن طريق تثبيط الاقتران ، وتعزيز معدل فقدان البلازميد ، أو كليهما (الشكل 4 أ). تعتمد فعالية هذه الإستراتيجية على مقدار (< eta _ < rm C >> ) الذي يتجاوز (< eta _ < rm Crit >> ). إذا كان (< eta _ < rm C >> ) أكبر قليلاً من (< eta _ < rm Crit >> ) ، فقد يكون منع الاقتران وحده كافياً لعكس المقاومة. ومع ذلك ، إذا كان التثبيط وحده غير مكتمل ، فإن الترويج κ قد تعمل في تآزر لزعزعة استقرار البلازميد.

اختبرنا أولاً استراتيجية التثبيط هذه على نظام الاقتران الهندسي باستخدام حمض اللينوليك 57 (لين) لتثبيط الاقتران (الشكل 4 ب ، اللوحة اليسرى) والفينوثيازين (فينو) لتعزيز خطأ الفصل البلازميدي 58 ، 59 (الشكل 4 ب ، اليمين) لوجة). تم تحديد كلا المركبين في الأدبيات لهذه الخصائص المحددة. الأهم من ذلك ، في التركيزات التي استخدمناها ، لم يؤثر أي من المركبين على معدل نمو البكتيريا (الشكل التكميلي 6 أ). في الواقع ، كان لين وحده كافيًا لزعزعة استقرار البلازميد بكفاءة اقتران منخفضة (الشكل 4 ج ، البلازميد K). بالنسبة للبلازميد مع أكبر (< eta _ < rm C >> ) (على سبيل المثال ، للبلازميد # 41) أو يمنح فائدة ، لم يكن لين وحده كافياً ، وكان التوليف التآزري بين Lin مع Pheno ضروريًا لعكس المقاومة (الشكل 4 د). نلاحظ أن Pheno وحده لم يؤثر على كفاءة الاقتران (الشكل التكميلي 6 ب).

عكس المقاومة بسبب المثابرة بمساعدة الاقتران. أ الجمع بين تثبيط الاقتران وتعزيز فقدان البلازميد لعكس المقاومة. من المتوقع أن تزيد هذه الإستراتيجية (< eta _ < rm Crit >> ) وتنقص (< eta _ < rm C >> ) ، مما قد يؤدي إلى زعزعة استقرار البلازميد (مكافئ (1)). ب تقييم مثبط الاقتران حمض اللينوليك (لين) ومحفز معدل فقدان البلازميد الفينوثيازين (فينو). إلى اليسار: نمت B K و R 0 بين عشية وضحاها مع أو بدون 3.25 ملي مولار لين لتقدير كفاءة الاقتران (انظر الطرق). يمينًا: تم نشر B K− يوميًا في وجود 50 ميكروغرام / مل Kan ، لا شيء ، أو 120 ميكرومتر من Pheno. تم استخدام Kan كعنصر تحكم. ص-المحور هو جزء B K− بدون مضاد حيوي تم تطبيعه بواسطة ذلك المعالج بـ Kan الذي تم قياسه عن طريق قياس التدفق الخلوي. زاد فينو بشكل كبير من معدل فقدان البلازميد بمقدار

أربعة أضعاف (انظر الشكل التكميلي 6 ب ، اللوحة اليمنى). ج, د تثبيط RK و R 41. تم خلط R 0 و R K أو R 41 في كسور متساوية وتم تخفيفها بمقدار 10000 × يوميًا لمدة 11 يومًا. ص-المحور هو جزء من الخلايا الحاملة للبلازميد و x-المحور أيام. يشير التظليل الأخضر إلى المعالجات من الظلام إلى النور: التحكم ، والفينو ، ولين ، والمختلطة. تم عكس كلا البلازميدات بنجاح عندما كان لين كافياً بمفرده ، وكان تأثير Pheno ضئيلاً (K). إذا كان لين وحده غير كافٍ ، فإن لين مع فينو قد زعزعا استقرار البلازميد. ه العلاج المركب بمقاومة Lin و Pheno مكبوتة أو معكوسة. تم استخدام نفس السلالات والبروتوكول كما في الشكل 2 د ، باستثناء الوسائط التي تم استكمالها بـ 3.25 ملي مولار لين و 120 ميكرومتر من الفينو طازجًا يوميًا (انظر الطرق). البلازميدات المستخدمة هي (i) # 168 ، (ii) # 193 ، (iii) R388 ، (iv) C ، (v) # 41 ، (vi) RP4 ، (vii) K ، (viii) PCU1 ، و (ix) ) R6K (انظر الجدولين التكميليين 1 و 3). تم إجراء جميع قياسات CFU في نسخ مكررة من أربعة إلى ستة لوحات ، وتكررت مرتين على الأقل من أجل التكاثر. تم نشر جميع قياسات التدفق مع ما لا يقل عن ثماني مكررات جيدة وتكرارها مرتين على الأقل من أجل التكاثر. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للوحة أو مكررات البئر

وجدنا أن لين قلل من كفاءة الاقتران لمعظم البلازميدات الأصلية بثلاثة أضعاف (الشكل التكميلي 6 ج) وحتى بمقدار 50 ضعفًا في واحد (انظر الجدول التكميلي 3 لجميع التغييرات الطية). تعديل هذا الانخفاض في (< eta _ < rm Crit >> ) ، والحفاظ على نفس التكلفة (الشكل التكميلي 6 د) ، وافتراض زيادة بمقدار أربعة أضعاف في معدل فقدان البلازميد المعزز بفينو (الشكل التكميلي S1) .6 ب ، يمين) ، يتنبأ معيارنا بأن الاستمرارية بمساعدة الاقتران ستنخفض بشكل كبير لمعظم البلازميدات (الشكل التكميلي 6E ، الجدول التكميلي 3). في الواقع ، أدى مزيج من Lin و Pheno إلى التخلص من البلازميدات بنسبة 99 ٪ حيث Δن & lt 0 (الشكل 4 هـ ، البلازميدات K ، # 41 ، # 168 ، PCU1 ، الشكل التكميلي 6F لـ PCU1 بمقياس اللوغاريتم مقارنة بالشكل التكميلي 3E). إذا Δن بالقرب من الصفر ولكن أكبر قليلاً من ذلك ، لا يزال البلازميد مستمراً ولكن مع عدوى أقل (الشكل 4 هـ البلازميدات C ، # 193). إذا Δن كبير بما فيه الكفاية (& gt & gt0) ، تم الحفاظ على البلازميد (الشكل 4e البلازميدات RP4 ، R6K ، R388). ومع ذلك ، كانت أقل هيمنة مقارنة بغياب Lin و Pheno (الشكل 2 د) ، مما يشير إلى دور الاقتران في صيانتها. ليس من المستغرب أن يكون عكس هذه البلازميدات الثلاثة أكثر صعوبة ، لأنها تحمل عبئًا صغيرًا أو حتى فائدة ، إلى R (الشكل التكميلي 3 ب).


عزل البلازميد ، يساعد في خطوة التخفيف؟ - (أبريل / 16/2009)

لقد قمت بعزل الحمض النووي الخاص بي وتحديده & # 39d وحصلت على تركيز 6.645 ميكروغرام / مايكرولتر. يحب مختبري تقسيم DNA البلازميد بمقدار 200 ميكروغرام من الحمض النووي ، وأحتاج إلى تخفيف تركيز DNA البلازميد إلى 1 ميكروغرام / مايكرولتر. كيف فعلتها؟ لدي إجمالي حجم 98 ماي وبهذا القالب الذي نستخدمه ، يقول استخدام 30.10 ميكرولتر لـ 200 ميكروغرام. لكن هذا التركيز لا يزال عند 6.645 ميكروغرام / مايكرومول؟

كنت تريد تخفيف البلازميد الخاص بك إلى 1 ميكروغرام / ماي.
تركيزك الأولي هو 6.645 ميكروغرام / لتر ، يجب أن تخفف 6.645 مرة.
الحجم الأولي الخاص بك هو 98 ماي. سيكون الحجم النهائي 98 * 6.645 = 651 ميكرولتر
لذلك ، أضف 553 ميكروليتر إلى 98 ميكروليتر (651-98 = 553 ميكروليتر) للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / ميكروليتر.

إذا كنت تريد قسمة 200 ميكروغرام ، فسيتعين عليك قسمة 200 ميكروليتر (1 ميكروغرام / لتر = 200 ميكروغرام / 200 ميكرولتر)

actin_crazy في 16 أبريل 2009 ، 06 & # 5825 صباحًا قال:

لقد قمت بعزل الحمض النووي الخاص بي وتحديده & # 39d وحصلت على تركيز 6.645 ميكروغرام / مايكرولتر. يحب مختبري تقسيم DNA البلازميد بمقدار 200 ميكروغرام من الحمض النووي ، وأحتاج إلى تخفيف تركيز DNA البلازميد إلى 1 ميكروغرام / مايكرولتر. كيف فعلتها؟ لدي إجمالي حجم 98 ماي وبهذا القالب الذي نستخدمه ، يقول استخدام 30.10 ميكرولتر لـ 200 ميكروغرام. لكن هذا التركيز لا يزال عند 6.645 ميكروغرام / مايكرومول؟

لا ، أضف 30.1ul (200ug) من المخزون إلى أنبوب جديد ، ثم أضف MQ أو المخزن المؤقت إلى 200ul ، بحيث يكون لديك 1ug / ul من البلازميد ولم يعد 6.645ug / ul

النقطة هي أن كمية البلازميد ثابتة في مخزونك الأولي ، يمكنك ضبط التركيز عن طريق إضافة حجم مختلف من المخزن المؤقت.

actin_crazy في 16 أبريل 2009 ، 03 & # 5825 م قال:

لقد قمت بعزل الحمض النووي الخاص بي وتحديده & # 39d وحصلت على تركيز 6.645 ميكروغرام / مايكرولتر. يحب مختبري تقسيم DNA البلازميد بمقدار 200 ميكروغرام من الحمض النووي ، وأحتاج إلى تخفيف تركيز DNA البلازميد إلى 1 ميكروغرام / مايكرولتر. كيف فعلتها؟ لدي إجمالي حجم 98 ماي وبهذا القالب الذي نستخدمه ، يقول استخدام 30.10 ميكرولتر لـ 200 ميكروغرام. لكن هذا التركيز لا يزال عند 6.645 ميكروغرام / مايكرومول؟


للحصول على الحمض النووي الخاص بك بتركيز 1ug / ul ، تحتاج إلى تخفيفه 6.645 مرة (أي إضافة 6.645 ضعف الحجم الذي لديك بالفعل).

طريقة أخرى لحساب هذا هي: C1V1 = C2V2
حيث C1 هو تركيزك الأولي (6.645ug / ul) ، V1 حجمك الأولي (98ul) ، C2 تركيزك النهائي (1ug / ul) و V2 الحجم النهائي الذي تحتاجه لذلك في هذه الحالة:
V2 = 6.645 * 98/1 = 651.21ul لذلك تحتاج إلى إضافة 553.21ul من أي حمض نووي مخفف فيه ، إلى 98ul الخاص بك.

إلى سؤالك الآخر ، سيحتوي 30.1 ul من 6.645ug / ul الخاص بك على 200ug (نعم ، لا يزال التركيز 6.645ug / ul طالما أنك لا تضيف أي شيء آخر إليه ، مما سيخففه ويقلل التركيز ، ولكنه سيظل كذلك. 200ug من الحمض النووي).

أوه & # 33 أخيرًا ، إذا كان ما تريده هو 200 ميكرو جرام من قسامات الحمض النووي @ 1ug / ul ، عليك فقط تقسيم 1ug / ul DNA (المخفف كما هو موضح أعلاه) إلى 200ul قسمة.

قال طبيب تقريبًا في 16 أبريل 2009 ، 06 & # 5843 صباحًا:

actin_crazy في 16 أبريل 2009 ، 03 & # 5825 م قال:

لقد قمت بعزل الحمض النووي الخاص بي وتحديده & # 39d وحصلت على تركيز 6.645 ميكروغرام / مايكرولتر. يحب مختبري تقسيم DNA البلازميد بمقدار 200 ميكروغرام من الحمض النووي ، وأحتاج إلى تخفيف تركيز DNA البلازميد إلى 1 ميكروغرام / مايكرولتر. كيف فعلتها؟ لدي إجمالي حجم 98 ماي وبهذا القالب الذي نستخدمه ، يقول استخدام 30.10 ميكرولتر لـ 200 ميكروغرام. لكن هذا التركيز لا يزال عند 6.645 ميكروغرام / مايكرومول؟


للحصول على الحمض النووي الخاص بك بتركيز 1ug / ul ، تحتاج إلى تخفيفه 6.645 مرة (أي إضافة 6.645 ضعف الحجم الذي لديك بالفعل).

طريقة أخرى لحساب هذا هي: C1V1 = C2V2
حيث C1 هو تركيزك الأولي (6.645ug / ul) ، V1 حجمك الأولي (98ul) ، C2 تركيزك النهائي (1ug / ul) و V2 الحجم النهائي الذي تحتاجه لذلك في هذه الحالة:
V2 = 6.645 * 98/1 = 651.21ul لذلك تحتاج إلى إضافة 553.21ul من أي حمض نووي مخفف فيه ، إلى 98ul الخاص بك.

إلى سؤالك الآخر ، سيحتوي 30.1 ul من 6.645ug / ul الخاص بك على 200ug (نعم ، لا يزال التركيز 6.645ug / ul طالما أنك لا تضيف أي شيء آخر إليه ، مما سيخففه ويقلل التركيز ، ولكنه سيظل كذلك. 200ug من الحمض النووي).

أوه & # 33 أخيرًا ، إذا كان ما تريده هو 200 ميكرو جرام من قسامات الحمض النووي @ 1ug / ul ، عليك فقط تقسيم 1ug / ul DNA (المخفف كما هو موضح أعلاه) إلى 200ul قسمة.

شكرا على الردود. حاولت التخفيف والتقسيم باستخدام الطريقة الموضحة أعلاه ، لكنني حددت 200 قسامة وحصلت على تركيز أقل من 1 ميكروغرام / مايكرولتر؟

هل تمت معايرة الماصات بشكل صحيح؟

الماصات والمقاييس الطيفية دقيقة +/- بعض الأخطاء.

mdfenko في 17 أبريل 2009 ، 11 & # 5844 صباحًا قال:

هل تمت معايرة الماصات بشكل صحيح؟

الماصات والمقاييس الطيفية دقيقة +/- بعض الأخطاء.

على حد علمى. الماصات الخاصة بي جديدة تمامًا ومقياس الطيف الضوئي الذي أستخدمه هو مقياس شائع يستخدمه الجميع على الأرض.


من فضلك ، بعض النصائح حول Maxiprep - (مايو / 11/2006)

أنا & # 39m أقوم بإجراء Maxi-Prep وحققت نجاحًا واحدًا فقط. لنكون صادقين ، فإن بقية محاولاتي لم تكن جيدة حقًا.

أتساءل عما إذا كان بإمكان أي شخص الإجابة على الأسئلة التالية وإعطائي أيضًا بعض النصائح بصرف النظر عن تلك المتوفرة في دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لـ Quiagen (لقد جربت بعضًا منها).

بادئ ذي بدء ، ما المقدار الذي تحصل عليه عادةً عند استخدام MaxiPrep (مقابل 100 مل من Lb ، على سبيل المثال)؟ (ميكروغرام)

ثانيًا ، قرأت في مكان آخر أن بعض الأشخاص يضيفون الكلورامفينيكول دائمًا بغض النظر عن البلازميد الذي يقومون بتضخيمه.

ما مقدار OD للبكتيريا الذي تحققه قبل البدء في إجراء العمود؟ (أعتقد أنني لا أحقق مرحلة الهضبة)

هل تعتقد أن هناك أي مشكلة إذا قمت بوضع بعض منها مباشرة في وسط LB (مع مضاد حيوي) عند إزالة تجميد البكتيريا التي تم تحويلها بالفعل دون استخدام طبق.

هل تستخدم أنابيب البولي بروبيل لعمل MaxiPrep؟ هل هناك نوع آخر من الأنابيب أكثر ملاءمة؟

من فضلك أعطني المزيد من الاقتراحات.

بادئ ذي بدء ، ما المقدار الذي تحصل عليه عادةً عند استخدام MaxiPrep (مقابل 100 مل من Lb ، على سبيل المثال)؟ (ميكروغرام)
- & # 62 للبلازميدات منخفضة النسخ ، حتى 200 مل ، للبلازميدات عالية النسخ ، 50 مل قم بالمهمة

ثانيًا ، قرأت في مكان آخر أن بعض الأشخاص يضيفون الكلورامفينيكول دائمًا بغض النظر عن البلازميد الذي يقومون بتضخيمه.
- & # 62 بالنسبة للبلازميدات منخفضة النسخ ، فأنت بحاجة إلى كمية أكبر من البكتيريا. يمكن أن يتسبب ذلك في تلوث الحمض النووي الريبي في الإعداد الخاص بك ، بسبب صعوبة التخلص من الكمية القادمة من المزيد من البكتيريا. لهذا السبب قد يضيف الناس الكلورامفينيكول للتخلص من النسخ III. تتوقف البكتيريا عن النمو وتقوم فقط بتكرار البلازميدات لتكون في الخطوط العامة. يؤدي ذلك إلى تقليل كمية الحمض النووي الريبي (RNA) ، دون فقدان فوائد الثقافة الكبيرة

ما مقدار OD للبكتيريا الذي تحققه قبل البدء في إجراء العمود؟ (أعتقد أنني لا أحقق مرحلة الهضبة)
مرحبًا ، قم بثقافة 12-16 ساعة عند 37 درجة

هل تعتقد أن هناك أي مشكلة إذا قمت بوضع بعض منها مباشرة في وسط LB (مع مضاد حيوي) عند إزالة تجميد البكتيريا التي تم تحويلها بالفعل دون استخدام طبق.
أحاول دائمًا أن أضع الطبق. لكنني لا أميل دائمًا إلى الصفيحة (ولكن في هذه الحالة ، يكون هذا بالنسبة للبلازميدات غير المسببة للمشكلة)

هل تستخدم أنابيب البولي بروبيل لعمل MaxiPrep؟ هل هناك نوع آخر من الأنابيب أكثر ملاءمة؟
ليس لدي أدنى فكرة عن تكوين الأنابيب الخاصة بي. لكنني أعتقد أن الأمر كذلك. هم الصقر.

عادة ما أزرع من أجل ماكسي الإعدادية في 250 مل أو 500 مل. مع 500 مل ، تصل إلى 1 ملغ من الحمض النووي.

باستخدام بلازميدات عالية النسخ ، يمكنك الحصول على أكثر من 600 ميكروغرام من 100 مل.

أنا لا أتحقق من التطوير التنظيمي أبدًا. لدي ثقافة miniprep في 4C واستخدم 100uL لتلقيح maxi.

إذا كانت البكتيريا الخاصة بك لا تنمو ، فابدأ بزرع 5 مل في الصباح من مستعمرة واحدة ثم قم بزراعتها لمدة 9-12 ساعة ثم استخدمها لتلقيح الحد الأقصى.

لست متأكدًا من مادة الأنابيب. أعتقد أنه لا ينبغي أن يكون مهمًا كثيرًا.

أقوم بإجراء تحضيرات ماكسي لترنسفكأيشن HEK293E المزروع في معلق.

عادةً ما أحقق 850 ميكروغرامًا إلى 1 مجم لكل مل (تمت التصفية التتابعية باستخدام مل من TE). هذا كافٍ لإعادة نقل لتر من HEK293E مع البولي إيثيلينيمين.

أي نوع من العوائد ترى؟

لقد استخدمت Maxipreps Qiagen من قبل ووجدت أنه بعد هطول الأمطار والطرد المركزي ، يمكن فقد الحبيبات بسهولة. الصب فكرة سيئة ، وحتى استخدام طرف ماصة يمكن أن يكون مشكلة لأن الحبيبات تتكسر إلى قطع صغيرة بسبب شفط القص. عليك أن تكون حذرًا للغاية وأن تزيل المادة الطافية بأقل قدر من التشويش على الحبيبات. بدلاً من ذلك ، بدلاً من القيام بترسيب الأيزوبروبانول ، ربما يحدث ترسيب الإيثانول. الحبيبات أسهل في الرؤية وأكثر إحكاما.
أميل إلى ترسيب الأيزوبروبانول ثم أضع المحلول في 15 أنبوبًا إيبندورف. هذا يجعل من السهل رؤية الحبيبات وبالتالي منع فقدانها. أقوم بتدوير الكريات وغسلها وتجفيفها ثم إعادة تعليق الحبيبات في الماء ، والانتقال من أنبوب إلى أنبوب لتركيز النتوء.

أقوم بإجراء تحضيرات ماكسي لترنسفكأيشن HEK293E المزروع في معلق.

عادةً ما أحقق 850 ميكروغرامًا إلى 1 مجم لكل مل (تمت التصفية التتابعية باستخدام مل من TE). هذا كافٍ لإعادة نقل لتر من HEK293E ببولي إيثيلينيمين.

أي نوع من العوائد ترى؟

مدهش & # 33 على الرغم من أن Maxiprep كان يصل إلى 500 ميكروغرام ، على الأقل هذا ما يقال في الكتيب كم سأحصل عليه؟ في أفضل محاولتي ، فقط

250ug (وكنت سعيدًا بذلك حتى اكتشفت مدى فقره). بدأت أعتقد أنني ميؤوس منه. :-(

شيء آخر نسيت أن أسأله ومن الضروري أن أعرفه هو: pMEM هو نسخة منخفضة من البلازميد أو نسخة عالية؟ لقد افترضت أنها نسخة عالية ، لكن قد أكون مخطئًا. لم أتمكن من العثور على هذه المعلومات في الشبكة. أي شخص يعرف؟

حول ML1975 ، أعتبر أسلوبًا جيدًا حقًا ، ويستغرق وقتًا أطول ولكن من المرجح أن يكون ناجحًا.

بخصوص scolix ، هل تنصحني بمحاولة زراعة البلازميد الخاص بي في وسط أكثر؟ أستخدم 100 مل فقط لمدة 12-16 ساعة ، كما قال فريد بشكل صحيح. عن & quot لدي ثقافة miniprep في 4C واستخدم 100uL لتلقيح maxi. & quot ، هل تقصد البكتيريا المحولة من miniprep؟ كم ساعة تسمح لهم بالنمو قبل البقاء في 4C؟ كم من الوقت تحتفظ بها في 4C؟

شيء أخير. لقد كنت أقوم بعمل المواد الهلامية التحليلية المناسبة وأعتقد أن مشكلتي تكمن في الجزء الأول ، فقط عندما يكون لديك نمو ثقافتك ، ثم تضيف إلى العمود وجهاز الطرد المركزي (أجمع العينة الأولى من هذا الطاف). في تلك المرحلة ، تكون فرقتي في الجل باهتة للغاية. لا أعتقد أنها خطوة التحلل لأن هذا الكاشف الأزرق الجديد يجعل الأمور أسهل.

آسف للعديد من الأسئلة. وشكرا جزيلا لكم جميعا.

أنا & # 39m أقوم بإجراء Maxi-Prep وحققت نجاحًا واحدًا فقط. لنكون صادقين ، فإن بقية محاولاتي لم تكن جيدة حقًا.

أتساءل عما إذا كان بإمكان أي شخص الإجابة على الأسئلة التالية وإعطائي أيضًا بعض النصائح بصرف النظر عن تلك المتوفرة في دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لـ Quiagen (لقد جربت بعضًا منها).

بادئ ذي بدء ، ما المقدار الذي تحصل عليه عادةً عند استخدام MaxiPrep (مقابل 100 مل من Lb ، على سبيل المثال)؟ (ميكروغرام)

ثانيًا ، قرأت في مكان آخر أن بعض الأشخاص يضيفون الكلورامفينيكول دائمًا بغض النظر عن البلازميد الذي يقومون بتضخيمه.

ما مقدار OD للبكتيريا الذي تحققه قبل البدء في إجراء العمود؟ (أعتقد أنني لا أحقق مرحلة الهضبة)

هل تعتقد أن هناك أي مشكلة إذا قمت بوضع بعض منها مباشرة في وسط LB (مع مضاد حيوي) عند إزالة تجميد البكتيريا التي تم تحويلها بالفعل دون استخدام طبق.

هل تستخدم أنابيب البولي بروبيل لعمل MaxiPrep؟ هل هناك نوع آخر من الأنابيب أكثر ملاءمة؟

من فضلك أعطني المزيد من الاقتراحات.

أولاً أتفق مع ML1975. في بعض الأحيان يكون من السهل فقدان الحبيبات ، لذلك عليك أن تكون بحذر شديد عند التخلص من SN. ضع علامة على الحبيبات خارج الأنبوب ولاحظ عند صب المادة الطافية
نقطة أخرى: عندما أقوم بإعداد أول مرة ، يكون لدي كمية منخفضة مماثلة من الحمض النووي على الرغم من أنني استخدمت نسخة عالية من البلازميد ولكن بعد تغيير الخلايا المختصة ، كان الإعداد الخاص بي ناجحًا للغاية. ربما وقت تخزين ج. الخلايا طويلة أو (كما في حالتي) جرب سلالة بكتيرية أخرى لـ c.c.
حظا سعيدا & # 33
فلوش

لا تقلق ، أن تحصل على عوائد منخفضة. لا بد لي من استخدام 500 مل من الثقافة للحصول على 1 ملغ. لذلك لا تقلق. إذا كنت بحاجة إلى مزيد من الحمض النووي ، فزرعه في وسط أكثر. وأيضًا مثلما كتبت قبل البدء بثقافة 5 مل وتنمو خلال النهار ثم استخدم ثقافة 5 مل لتلقيح 500 مل.

لا أعرف ما إذا كان pMEM نسخة منخفضة البلازميد أو نسخة عالية.

أزرع minipreps لمدة 14-16 ساعة. وأنا أستخدم معظمها للتحقق مما إذا كان الاستنساخ ساريًا بشكل صحيح. وتخزين ما تبقى منه في 4C. لن أستخدم أي شيء أكثر من أسبوع في 4C. سيكون من الأفضل إعادة تحويل الحمض النووي من miniprep (تم تأكيده عن طريق التقييد) واستخدام مستعمرة واحدة لتنمية الحد الأقصى.

& quot & quotO شيء واحد أخير. لقد كنت أقوم بعمل المواد الهلامية التحليلية المناسبة وأعتقد أن مشكلتي تكمن في الجزء الأول ، فقط عندما يكون لديك نمو ثقافتك ، ثم تضيف إلى العمود وجهاز الطرد المركزي (أجمع العينة الأولى من هذا الطاف). في تلك المرحلة ، تكون فرقتي في الجل باهتة للغاية. لا أعتقد أنها خطوة التحلل لأن هذا الكاشف الأزرق الجديد يجعل الأمور أسهل. & quot & quot

أنا لا أفهمك هنا. يرجى توضيح.

لا تقلق بشأن الجزء الأخير ، لقد أعطيتني بالفعل فكرة بثقافة 500 مل. إنه من أول الأشياء التي سأحاولها.

لقد بدأت للتو في القيام بكل تقنيات الاستنساخ هذه ولم أحاول أبدًا عملية الهضم المقيد (يجب أن يكون الأمر سهلاً في معظم الحالات ، على ما أعتقد). أنا أستخدم PCR بدلاً من ذلك مع بادئات محددة ، فهل هذا صحيح بنفس القدر في عملية الهضم المقيدة؟ ما هي الميزة الرئيسية لتقييد الهضم؟ لتوفير الوقت؟ كلفة؟

أي شخص يعرف عن pMEM ، إذا كان منخفض أو مرتفع نسخة البلازميد؟ أو أين يمكنني أن أجد مثل هذه المعلومات؟

لقد جربت هذا ولم يكن ناجحًا. كم بيليه البكتيريا تحصل عليها؟ ما مقدار P1 و P2 و P3 الذي تستخدمه بعد ذلك؟ لأنني عندما حاولت بالمبلغ المضاعف الموصى به لـ MaxiPrep ، حصلت على محلول لزج جدًا (P1 و P2) ولم أستطع التخلص من جميع الكتل.

في البروتوكول ينصحونك بالتركيز مرتين على خليط P1 و P2 و P3 وأخذ جزء من المادة الطافية الناتجة التي تحتوي على البلازميد لتشغيل هلام تحليلي. فعلت هذا ولم أحصل على أي شيء على الإطلاق في جل. لذلك ، أعتقد أن مشكلتي هي قبل إضافة أي شيء إلى الحافة مباشرة ، عندما أحصل على حبيباتي وأمزجها مع P1 و P2 و P3 (وهي تلون اللون الأزرق الجديد).

حول الخلايا المختصة ، استخدم كلا البلازميد نفس دفعة الخلايا المختصة ، في نفس اليوم. الأول كان على ما يرام (250ug) والآخر كان 45ug فقط.

في المرة الأولى التي حاولت فيها ، حصلت على نتيجة جيدة (بالنسبة لي ، لأنها كانت 250 ميكروغرام فقط). ولكن مع هذا البلازميد ، فقدت للغاية في الوقت الحالي. يمكن لأي شخص أن يشرح لي ما أفعله خطأ؟


استجابة صارمة. في ذبابة الفاكهة؟

إذا صادفت أنك بكتيريا ، يجب أن تستعد للمتاعب: نقص الطعام ، تغيرات درجة الحرارة وما إلى ذلك. وعندما تأتي المشكلة ، يجب أن تستجيب وفقًا لذلك. يقوم نظام الاستجابة الصارمة بما يلي بالضبط: فهو يدمج العديد من مصادر المدخلات (الأحماض الأمينية ، والحد من الدهون والكربون ، ورفع درجة الحرارة على سبيل المثال لا الحصر) ويغير تركيز جزيء المنبه ppGpp (الناتج المحلي الإجمالي مع 2 فوسفات إضافي مرتبط بجزء السكر).

ينظم ppGpp بدوره كل شيء: النسخ والترجمة والنسخ المتماثل. لذلك من الضروري التحكم في مستويات ppGpp بدقة شديدة ، ولهذه الغاية ، تمتلك البكتيريا بروتينات تنتج ppGpp (RelA) ، (في الغالب) تحللها (SpoT) وتقوم بكليهما (Rel). تسمى كل هذه البروتينات معًا متماثلات RelA-SpoT (RSH).

كل هذا في البكتيريا. ماذا عن حقيقيات النوى؟ حسنًا ، العضيات لديها RSH ، وبعضها غريب نوعًا ما من حيث الإشارات التي تستجيب لها ، مثل Ca ++ الحساسة OsCRSH1 RSH من البلاستيدات الخضراء. ولكن ماذا عن البروتينات الخلوية؟

تم اكتشافه بالضبط في عام 2010 - عصاري خلوي RSH Mesh1 في درووفيلا. إنه بروتين صغير ، قادر فقط على التحلل المائي لـ ppGpp ، وهو ما يفعله على وجه التحديد: فهو يأخذ هذا النوكليوتيد فقط من بين مجموعة متنوعة من البروتينات المختلفة التي تم اختبارها. الضربة القاضية لها نمط ظاهري قوي ومحدد ، مما يشير إلى أن Mesh1 مهمة وعملية. علاوة على ذلك ، يمكن لـ Mesh1 أن تحل محل SpoT في البكتيريا. تم حل بنية البروتين بالأشعة السينية ، لذلك ذهب البحث إلى Nature Structural Biology.

السؤال الكبير هنا هو كيف انتهى المطاف بـ Mech1 في حقيقيات النوى ولماذا تم الاحتفاظ بها هناك؟ كيف تنقل نظامًا معقدًا مثل الاستجابة الصارمة من البكتيريا إلى حقيقيات النوى؟

مع بروتينات RSH ، لا يمكن للمرء أن يمتلك فقط واحدًا منتِجًا لـ ppGpp - في هذه الحالة أنت تنتج ppGpp ، وتتراكم وتموت الخلل. لذلك عادةً ما تحتوي الحشرات على Rel - فهي تصنع وتحلل ppGpp ، وبالتالي فإن النظام بأكمله موجود في بروتين واحد. يحلل Mesh1 ppGpp ، ولم يتم تحديد RSH الخلوي القادر على التوليف في حقيقيات النوى حتى الآن. فما الذي تفعله Mesh1؟ ماذا او ما هل هي مهينة؟

قد يكون هناك بعض البروتين المنتج لـ ppGpp والذي لا يتماثل مع RSH ، وهذا هو مصدر ppGpp الذي يتحلل منه Mesh1. ومع ذلك ، كانت محاولات اكتشاف ppGpp أثناء الحرمان من الأحماض الأمينية فاشلة على الدوام. لذلك قد يكون Mesh1 في الواقع يفعل شيئًا آخر ثم التحلل المائي PPGpp.

Sun D و Lee G و Lee JH و Kim HY و Rhee HW و Park SY و Kim KJ و Kim Y و Kim BY و Hong JI و Park C و Choy HE و Kim JH و Jeon YH و Chung J (2010). يتحلل أخصائي تقويم العظام في SpoT pppGpp ويعمل في استجابات الجوع. الطبيعة الهيكلية والبيولوجيا الجزيئية ، 17 (10) ، 1188-94 بميد: 20818390

Mitkevich VA و Ermakov A و Kulikova AA و Tankov S و Shyp V و Soosaar A و Tenson T و Makarov AA و Ehrenberg M و Hauryliuk V (2010). التوصيف الديناميكي الحراري لربط ppGpp بـ EF-G أو IF2 وربط الحمض الريبي النووي النقال البادئ بـ IF2 المجاني في وجود الناتج المحلي الإجمالي أو GTP أو ppGpp. مجلة البيولوجيا الجزيئية، 402 (5)، 838-46 PMID: 20713063

Maciag M و Kochanowska M و Lyzeń R و Wegrzyn G و Szalewska-Pałasz A (2010). PPGpp يثبط نشاط Escherichia coli DnaG primase. بلازميد ، 63 (1) ، 61-7 بميد: 19945481

Gralla JD (2005). نسخ Escherichia coli ribosomal RNA: الأدوار التنظيمية لـ ppGpp و NTPs والبروتينات المعمارية وبروتين ربط البوليميراز. علم الأحياء الدقيقة الجزيئي، 55 (4)، 973-7 PMID: 15686546

بولارد جي دبليو ، لام تي ، وستانرز سي بي (1980). لا تتمتع خلايا الثدييات باستجابة صارمة. مجلة علم وظائف الأعضاء الخلوية، 105 (2)، 313-25 PMID: 7462330

باكشتاين MH و He J و Rubin H (2008). توصيف برك النوكليوتيدات كدالة للحالة الفسيولوجية في الإشريكية القولونية. مجلة علم الجراثيم ، 190 (2) ، 718-26 بميد: 17965154


إعادة النظر

مقدمة

الصيانة المستقرة في الخلايا المضيفة هي أهم عملية لأي بلازميد بكتيري. هناك آليات مختلفة تستخدمها البلازميدات المختلفة لتحقيق ذلك. أولاً ، يجب أن تتكاثر البلازميدات في كثير من الأحيان بما يكفي لإنتاج نسخها بكميات تسمح بتوزيعها على كلتا الخلايا الوليدة بعد انقسام الخلية الأم. من ناحية أخرى ، لمنع استنفاد الطاقة للمضيف الذي يؤدي إلى موت الخلية ، يجب ألا يكون تواتر تكاثر البلازميد مرتفعًا جدًا. ثانيًا ، بعد جولة النسخ المتماثل ، يجب تقسيم جزيئات البلازميد الابنة بكفاءة. ثالثًا ، ظهور خلايا أقل بلازميدًا في مجموعة من البكتيريا التي حملت البلازميدات في الأصل هو عيب خطير من وجهة نظر هذه العناصر الوراثية خارج الصبغيات ، حيث تنمو الخلايا الخالية من البلازميدات عادةً بشكل أسرع من تلك التي تحمل مثل هذه الجزيئات "الإضافية". وهكذا ، فإن الخلايا الخالية من البلازميد ستفوز في المنافسة مع البكتيريا التي تؤوي البلازميد في غياب الضغط البيئي الذي يفضل الخلايا التي تحمل DNA البلازميد. لذلك طورت بعض البلازميدات آليات قتل البكتيريا التي فقدتها.

تمت مراجعة الهياكل الوراثية لنسخ البلازميد ، والكيمياء الحيوية لبدء النسخ المتماثل للبلازميدات المختلفة ، وآليات تقسيم جزيئات البلازميد ، وعمليات التنظيم بعد الفصل لاستقرار البلازميد في خطوط الخلايا البكتيرية مؤخرًا في العديد من المقالات الممتازة [1-7]. لذلك ، لن يتم مناقشة هذه المشاكل بالتفصيل في هذه المراجعة. هنا ، نركز على تنظيم تكاثر البلازميد استجابة للضغوط الخلوية المختلفة. كنموذج ، اخترنا البلازميدات المشتقة من العاثية λ ، تسمى λ البلازميدات. قدمت النتائج المنشورة مؤخرًا بيانات جديدة تسمح لنا بفهم أفضل لتكرار هذه البلازميدات في الخلايا التي تنمو في ظل ظروف بيئية مختلفة. علاوة على ذلك ، ستتم مناقشة بعض الدراسات الحديثة الأخرى حول هذا النوع من التنظيم في النسخ المتماثلة البلازميدية الأخرى.

Λ بلازميدات

Bacteriophage هو فيروس معتدل يصيب الإشريكية القولونية الخلايا. لعبت هذه العاثية دورًا حاسمًا في تطوير البيولوجيا الجزيئية ولا تزال نموذجًا مفيدًا للغاية في الدراسات حول الآليات الجزيئية لتنظيم الوظائف الخلوية الأساسية ، حيث كانت بمثابة نموذج للعديد من العمليات البيولوجية العامة [8-11]. علاوة على ذلك ، فإن العاثيات المعدلة وراثيًا وشظايا جينوماتها تستخدم على نطاق واسع في الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية [12-17].

يتكون البلازميد النموذجي من جزء من جينوم العاثية الذي يحتوي على جميع الجينات والتسلسلات التنظيمية اللازمة لبدء تكرارها في بكتريا قولونية. تم عزل البلازميدات الأولى من هذا النوع كمشتقات لجينوم العاثية ، التي تنتجها في الجسم الحي أحداث إعادة التركيب [18]. حاليًا ، يتم إنشاء هذه البلازميدات باستخدام طرق الهندسة الوراثية ، وغالبًا ما تحتوي ، بصرف النظر عن منطقة التكرار ، على علامة جينية ، على سبيل المثال جين مقاوم للمضادات الحيوية. منذ هيكل λ البلازميدات ، والوظائف الأساسية لجينات λ النسخ المتماثل وآلية بدء النسخ المتماثل من أوري λ تمت مراجعته مؤخرًا [19-22] ، في هذه المقالة نقدم فقط معلومات أساسية حول بدء λ تكرار الحمض النووي ، وهو أمر ضروري لفهم الآليات التنظيمية التي تعمل في ظل ظروف الإجهاد المختلفة.

يبدأ تكرار λ DNA البلازميد في أوري λ المنطقة الواقعة في منتصف ا الجين (الشكل 1). يرمز هذا الجين لبروتين بادئ النسخ ، والذي يرتبط بأصل النسخ المتماثل ، ويشكل بنية البروتين النووي المسماة "O-some". يتم تسليم هليكاز DnaB المشفر بالمضيف إلى O-some بواسطة بروتين نسخ آخر ، وهو ص منتج الجينات. ال أوري هيكل λ-O-P-DnaB ، المسمى "pre-primosome" مستقر ولكنه غير نشط في تعزيز تكرار الحمض النووي ، حيث تمنع التفاعلات القوية بين بروتينات P و DnaB نشاط الهليكس للمكون الأخير. تأثير بروتينات الصدمة الحرارية: DnaK و DnaJ و GrpE ، ضروري لتحرير DnaB من التثبيط بوساطة P ، على الرغم من أن بروتين P يبدو أنه لا يزال موجودًا في المجمع. تشير الدراسات الحديثة (انظر الفصل التالي) إلى أن DnaK يظل ملزمًا أيضًا بـ أوري مجمع λ-O-P-DnaB. تقترن عملية إعادة عرض ما قبل البريموسوم المعتمد على الكفيل مع التنشيط النسخي لـ أوري λ ، إجراء النسخ في النسخ المتماثل الأصل منطقة. التنشيط النسخي لملف الأصل ضروري لبدء فعال λ تكرار الحمض النووي في الجسم الحي حتى لو تم توفير جميع بروتينات النسخ المتماثل. يبدو أن التغييرات في طوبولوجيا الحمض النووي الناتجة عن حركة بوليميريز الحمض النووي الريبي أثناء النسخ تلعب دورًا مهمًا في تحفيز بدء النسخ المتماثل. λ صص المروج هو موقع بدء طبيعي للنسخ الذي ينتج mRNA لتخليق λ بروتينات النسخ المتماثل (O و P) ويعمل على التنشيط أوري λ. الخطوة الأخيرة في بدء λ تكرار الحمض النووي هي ربط أنزيم DNA polymerase III وبروتينات النسخ الإضافي (DNA gyrase و SSB وغيرها) المشفرة بواسطة المضيف إلى أوري λ المنطقة.

منطقة النسخ المتماثل لجينوم العاثية λ وتجميع مجمع النسخ المتماثل. يشار إلى الجينات والمحفزات والنهايات الموجودة في منطقة النسخ المتماثل. يتم تمثيل النصوص بواسطة الأسهم. لم يتم رسم المخطط على نطاق واسع. انظر النص للحصول على التفاصيل.

تكرار λ البلازميدات في الخلايا المتعطشة للأحماض الأمينية

تجويع الأحماض الأمينية يؤدي إلى استجابة محددة للخلايا البكتيرية تسمى الاستجابة الصارمة [23]. في ظل هذه الظروف ، فإن منتج ريلا يتم تنشيط الجين لإنتاج نيوكليوتيدات إشارة محددة ، غوانوزين 5-ثلاثي فوسفات -3 ثنائي فوسفات (pppGpp) وغوانوزين 5'-ثنائي فوسفات-3'-ثنائي فوسفات (ppGpp). تتفاعل هذه النيوكليوتيدات مع بوليميراز الحمض النووي الريبي مسببة تغييرات جذرية في كفاءة النسخ من مختلف المروجين. المروجين لتخليق الحمض النووي الريبي المستقر هي المروجين الأكثر حساسية لـ (p) ppGpp. لا تتأثر بعض المحفزات بهذا النيوكليتيد ، في حين أن المحفزات الأخرى يمكن إما تثبيطها أو تحفيزها في البكتيريا البرية المتعطشة للأحماض الأمينية [23].

λصص المروج تم تنظيمه بشكل سلبي بواسطة ppGpp [24-26]. انخفاض في نشاط صص يؤدي إلى ضعف تنشيط النسخ أوري λ وتثبيط λ تكاثر DNA البلازميد. مثل هذا التنظيم منطقي ، حيث يمكن للمرء أن يتخيل أن تثبيط العمليات التي تتطلب استهلاكًا واسعًا للطاقة (مثل تكرار الحمض النووي) يجب أن يكون ميزة للخلية المضيفة المعرضة للخطر بسبب الجوع.

ومن المثير للاهتمام، بكتريا قولونية المسوخ في ريلا الجين المعيب في إنتاج (p) ppGpp في الخلايا المتعطشة للأحماض الأمينية (تسمى استجابة البكتيريا لتجويع الأحماض الأمينية الاستجابة المريحة) ، يمكن أن تدعم تكاثر λ البلازميدات [27 ، 28]. كان هذا الاكتشاف غير متوقع ، حيث أشارت الدراسات السابقة [29 ، 30] بقوة إلى أن البادئ في تكرار الحمض النووي ، وهو بروتين O المشفر λ ، غير مستقر للغاية في بكتريا قولونية الخلايا. تم اقتراح أنه بعد كل تكرار حول هذا البروتين يتحلل ويكون تخليق جزيئات بروتين O الجديدة ضروريًا لبدء النسخ المتماثل اللاحق للبلازميد [31]. لذلك ، يمكن للمرء أن يتنبأ بأن تثبيط تخليق البروتين O في الخلايا المتعطشة للأحماض الأمينية ، والذي تم إثباته تجريبيًا [32] ، يجب أن يؤدي إلى منع بدء النسخ المتماثل من أوري λ. حدث مثل هذا التثبيط في الخلايا البرية المتعطشة للأحماض الأمينية ، ولكن ليس في ريلا المسوخ. λ يعتمد تكاثر البلازميد أثناء الاستجابة المريحة بشدة على نشاط البروتين O [28 ، 33] ، لذلك يجب أن يظل بادئ النسخ المتماثل هذا يعمل أثناء توقف تركيبه. كشفت دراسات أكثر تفصيلاً أن بروتين O محمي من التحلل البروتيني (الذي يتم إجراؤه بواسطة ClpP / ClpX protease [34 ، 35]) بواسطة مكونات أخرى من مركب λ النسخ المتماثل ، المتكون في أوري ^ [32 ، 36 ، 37]. مثل هذا المركب عبارة عن بنية مستقرة ، موروثة بواسطة واحدة من نسختين من DNA البلازميد بعد كل جولة تكرار ، وقد يعمل في أحداث النسخ المتماثل اللاحقة [32 ، 38].

أدت الدراسات التي أجريت على تكاثر λ البلازميدات في الخلايا المتعطشة للأحماض الأمينية ، والتي تم تلخيصها أعلاه ، إلى نموذج جديد لتنظيم تكرار هذه النسخ المتماثلة (الشكل 2). وفقًا لهذا النموذج ، هناك مساران لتكاثر البلازميد. يعتمد المسار الأول على نشاط مجمع النسخ المتماثل الموروث الموجود فقط على نسخة ابنة واحدة بعد جولة النسخ المتماثل. على نسخة البلازميد الخالية من المركب الوراثي ، يجب تجميع مجمع نسخ جديد. تتطلب كل من المجمعات الموروثة والمجمعة حديثًا أنشطة لبروتينات الصدمة الحرارية (DnaK و DnaJ أو متماثلها CbpA [39] و GrpE) وتنشيط النسخ من الأصل لبدء جولة تكرار جديدة (انظر المرجع [22] للحصول على مراجعة مفصلة). توجد مجمعات النسخ المتماثل القابلة للتوريث في كل من الخلايا البرية و ريلا المسوخ. ومع ذلك ، في البكتيريا المتعطشة للأحماض الأمينية قادرة على إنتاج (p) ppGpp ، نشاط صص المروج انخفض بشكل كبير ، مما يؤدي إلى تنشيط النسخ غير الفعال لـ أوري λ وتثبيط بدء النسخ المتماثل. من ناحية أخرى ، أثناء الاستجابة المريحة ، في حالة عدم وجود كميات عالية من (p) ppGpp صص المروج نشط بالكامل ، ويمكن أن يستمر النسخ المتماثل الذي ينفذه مجمع النسخ المتماثل الوراثي.

مساران لتكاثر λ البلازميد. تمثل الدوائر الكبيرة جزيئات DNA البلازميد. تشير الدوائر الصغيرة المملوءة (البرتقالية) إلى مجمعات النسخ المتماثل القابلة للتوريث. انظر النص للحصول على التفاصيل.

نتائج السابق في الجسم الحي[36] و في المختبر[40] اقترحت التجارب أن معقد النسخ المتماثل الموروث يحتوي على بروتينات O و P و DnaB. كشفت الدراسات الحديثة أن هذا المركب يتكون من هذه البروتينات بالإضافة إلى بروتين DnaK [41]. قد يستمر النسخ المتماثل الذي يتم إجراؤه بواسطة المركب القابل للتوريث إما بشكل ثنائي أو أحادي الاتجاه (يسارًا أو يمينًا) ، على غرار النسخ المتماثل الذي يتم إجراؤه بواسطة مجمع تم تجميعه حديثًا [42]. يتم توريث مجمع النسخ بشكل عشوائي بعد جولة النسخ المتماثل في حد متساوٍ بواسطة نسخة تحتوي على DNA الوالدين ل حبلا أو الوالدين ص حبلا [43].

كان للدراسات المتعلقة بتنظيم تكاثر λ البلازميد في الخلايا المتعطشة للأحماض الأمينية آثار تكنولوجية حيوية. يؤدي نقص الأحماض الأمينية إلى تثبيط نمو الخلايا. لذلك ، في ظل هذه الظروف ، يؤدي التكرار الفعال لجزيئات λ البلازميد إلى تضخيم DNA البلازميد في الخلايا. في الواقع ، لوحظ تضخيم فعال λ البلازميدات في ريلا المسوخ ، سواء أثناء تجويع الأحماض الأمينية والحد منها [44 ، 45]. نظرًا لاستخدام مشتقات λ البلازميدات كناقلات استنساخ [15 ، 16] ، فقد يكون تضخيمها مفيدًا في مختبرات التكنولوجيا الحيوية.

التنظيم المعتمد على معدل النمو λ رقم نسخة البلازميد

يمكن زراعة البكتيريا بوسائل مختلفة تدعم معدلات النمو المختلفة. يعتمد عدد نسخ البلازميد في الخلايا البكتيرية بشكل أساسي على تواتر بدء تكاثر البلازميد ، والذي قد يختلف بشكل كبير اعتمادًا على معدل النمو الخلوي. وجد أن λ عدد نسخ البلازميد أعلى في الخلايا التي تنمو بشكل أسرع [46]. يبدو أنه في الخلايا التي تنمو ببطء ، يكون مستوى البروتين O هو العامل المحدد لبدء النسخ المتماثل عند أوري λ. تعتمد هذه الفرضية على التجارب التي أشارت إلى وجود خلل وظيفي في clpP, clpX أو كلا الجينين (الترميز لمكونات بروتين ClpP / ClpX المهين من O) يلغي تمامًا الاختلافات في عدد نسخة البلازميد التي لوحظت في مضيف من النوع البري ينمو في وسائط مختلفة ، مما يدعم معدلات نمو مختلفة [46]. أدت المستويات المتزايدة من بروتين O أيضًا إلى تكاثر أكثر كفاءة بدأ في أوري λ ، ولكن فقط في البكتيريا التي تنمو ببطء في وسط فقير [47]. من الواضح أن مسار λ النسخ المتماثل للبلازميد بناءً على مجمعات النسخ المتماثل المجمعة حديثًا (قارن الشكل 2) يجب أن يتأثر في ظل هذه الظروف.

آلية هذا التنظيم غير واضحة. نشاط صص المروج ، والذي من خلاله ا تم نسخ الجين ، وجد أنه يعتمد على معدل النمو الخلوي ، على الرغم من أن الاختلافات في كفاءة النسخ بين معدلات النمو المختلفة كانت أقل وضوحًا من تلك الموجودة في عدد نسخة البلازميد [46]. يمكن للمرء أن يتكهن بأن بروتينات DnaA و SeqA ، والتي تعد منظمات لبدء تكاثر الكروموسوم البكتيري وأيضًا محفزات لـ صص المحفز [48-52] ، يلعب دورًا في استجابة هذا النشاط المعزز لمعدلات النمو المختلفة. ربما تكون الترجمة الأقل كفاءة في البكتيريا التي تنمو ببطء قد تكون مسؤولة أيضًا عن انخفاض مستويات بروتين O في ظل هذه الظروف.

الصدمة الحرارية وتكاثر البلازميد

تعتبر بروتينات الصدمة الحرارية DnaK و DnaJ (التي يمكن استبدالها بمثيلها المتماثل CbpA) و GrpE ضرورية للغاية لبدء تكرار الحمض النووي من أوري λ (للمراجعة انظر المراجع. [19-22]). تعيد هذه البروتينات تشكيل الجسيم المسبق لتحرير DnaB هيليكاز من التثبيط بوساطة P ، وربما تشارك أيضًا في التثبيت المناسب للهيليكاز في شوكات النسخ المتماثل. تشير النتائج الحديثة إلى أن أحد هذه البروتينات ، DnaK ، هو أحد مكونات λ معقد النسخ المتماثل الموروث [41].

على أساس الحقائق المعروضة أعلاه ، يمكن للمرء أن يتنبأ بأن الصدمة الحرارية قد تحفز تكرار λ البلازميدات. ومع ذلك ، ليس هذا هو الحال حيث تم إثبات أن λ عدد نسخة البلازميد انخفض عند 42 درجة مئوية بالنسبة لدرجات الحرارة المنخفضة (على سبيل المثال 30 أو 37 درجة مئوية) [44]. كشفت دراسات أكثر تفصيلاً أن مسار النسخ المتماثل الذي يعتمد على وظيفة مجمع النسخ المتماثل الوراثي يتضرر بسبب الصدمة الحرارية. وبالتحديد ، يتم تفكيك مركب التكاثر الوراثي ، والذي يعتبر في ظل الظروف المختبرية القياسية بنية مستقرة قادرة على العمل لأجيال عديدة من الخلايا ، بعد وقت قصير نسبيًا من نقل البكتيريا من 30 إلى 43 درجة مئوية [53]. وجد أن هذا التفكيك يعتمد على بروتينات الصدمة الحرارية GroEL و GroES [53]. في الواقع ، كان هذا هو أول عرض ، مدعومًا بالدراسات اللاحقة [54] ، أن نظام المرافقة الجزيئي GroEL / GroES يعمل في في الجسم الحي تفكيك بنية بروتينية عالية التنظيم.

تم توضيح آلية التفكيك المعتمد على GroEL / GroES والناجم عن الصدمة الحرارية لمركب النسخ المتماثل القابل للتوريث. تسبب الصدمة الحرارية ارتخاء جزئي وعابر للحمض النووي البلازميدي فائق الالتفاف. يؤدي إعادة الالتفاف اللاحق المعتمد على جيراس الحمض النووي إلى تفكك مجمع النسخ المتماثل ، والذي يتم تفكيكه بعد ذلك بواسطة نظام مرافق GroEL / GroES [55]. في ظل ظروف محددة (على سبيل المثال ، عدم وجود λ Cro repressor ، والذي يتم ترميزه بواسطة جين موجود في معظم البلازميدات) ، قد ينجو مركب النسخ المتماثل من الصدمة الحرارية بسبب تكوين بنية أكثر استقرارًا نتيجة للتفاعل مع البروتينات الأخرى [ 55]. واحد منهم هو بروتين DnaA المشفر من قبل المضيف [56].

باختصار ، بروتينات الصدمة الحرارية لها وظائف إيجابية وسلبية في تنظيم تكاثر λ البلازميد. ومن المثير للاهتمام ، أن إعادة الالتفاف الفائق للحمض النووي البلازميدي بعد ارتخاءه الجزئي الناجم عن الصدمة الحرارية ، وهو أمر ضروري لفصل مركب النسخ المتماثل الوراثي عن الحمض النووي ، يعتمد على وظيفة DnaK [57]. هذا يجعل تأثير بروتينات الصدمة الحرارية على تنظيم تكاثر البلازميد أكثر تعقيدًا (قارن الشكل 3). علاوة على ذلك ، تنتمي بروتينات ClpP و ClpX ، التي تشكل البروتياز الذي يحط من البروتين البادئ لتكرار O ، أيضًا إلى عائلة بروتين الصدمة الحرارية.

تأثيرات العوامل المختلفة على تكوين واستقرار مجمع النسخ المتماثل الموروث. المجمع يرمز له بدائرة برتقالية كبيرة. يتم تمييز المنظمين الموجبين باللون الأخضر ، والمنظمون السلبيون يتم تمييزهم باللون الأزرق. تظهر عمليات التحفيز على شكل أسهم ويتم عرض الإجراءات المثبطة بواسطة خطوط غير حادة الأطراف. انظر النص للحصول على التفاصيل.

الجمع بين زراعة البكتيريا لفترات طويلة (عدة ساعات) عند درجة حرارة مرتفعة (42-43 درجة مئوية) وتجويع الأحماض الأمينية له آثار ضارة على البلازميدات. وبالتحديد ، لوحظ تدهور DNA البلازميد في ظل هذه الظروف [58]. تم اكتشاف هذا التحلل في سياق الدراسات التي أجريت على λ تكاثر البلازميد ، ولكن ثبت بعد ذلك أنه مستقل عن بلازميد بليكون [58]. تظل آلية هذه الظاهرة غير معروفة ، على الرغم من أن المرء قد يتكهن بأن بعض وحدات إدمان البكتيريا التي يتم تنشيطها عند تجويع الأحماض الأمينية ، مثل مزف[59] ، يمكن أن تشارك.

تكرار λ البلازميدات في درجات حرارة منخفضة

يتم حظر التطور التحليلي للعاثيات λ عند درجة حرارة منخفضة تصل إلى 20-25 درجة مئوية [60 ، 61]. في الواقع ، حجم انفجار هذه العاثية بكتريا قولونية تزداد الخلايا تدريجياً على مدى درجة الحرارة من 20 إلى 37 درجة مئوية [62]. في درجات الحرارة المنخفضة ، وجد أن تكاثر الحمض النووي للعاثيات يُثبط [62 ، 63]. بشكل غير متوقع ، تم إثبات أن البلازميدات المشتقة من العاثية تتكاثر بشكل طبيعي عند 25 درجة مئوية [62].

ما هي آلية تنظيم استنساخ DNA البلازميد والعاثية المختلفة في درجات حرارة منخفضة؟ لقد تم إثبات أن λ بروتين CII المشفر بالعاثيات ينشط صه محفز (انظر الشكل 1) بكفاءة أكبر عند درجات حرارة أقل من درجات الحرارة المرتفعة [62 ، 63]. النسخ المحسن من صه قد تتداخل مع بدء النسخ من صص، والذي يتم توجيهه في الاتجاه المعاكس بالنسبة إلى صه (رسم بياني 1). نشاط منخفض صص يؤدي إلى إنتاج غير فعال لبروتينات النسخ المتماثل. لذلك ، يتم إعاقة تكوين مجمعات النسخ المتماثل الجديدة. لاحظ أنه في حالة عدوى الملتهمة ، يتم حقن الحمض النووي الفيروسي العاري في خلية مضيفة ، ويجب تجميع جميع مجمعات النسخ المتماثل من جديد. عندما تم فحص λ بلازميدات ، تم نقل الخلايا الحاملة للبلازميد من درجة الحرارة القياسية (عادة 37 درجة مئوية) إلى درجات حرارة منخفضة. لذلك ، كانت مجمعات النسخ المتماثل التي تم تجميعها مسبقًا موجودة في وقت تحول درجة الحرارة ، ويمكن أن تعمل في درجات حرارة منخفضة بغض النظر عن تثبيط تكوين معقد النسخ الجديد [62].

تأثير استجابة SOS على تكوين واستقرار مجمعات النسخ المتماثل

يؤدي تلف الحمض النووي إلى استجابة بكتيرية محددة للتوتر ، تسمى استجابة SOS [64]. يعد التشعيع فوق البنفسجي أحد العوامل التي تؤدي بشكل فعال إلى استجابة SOS. تم إثبات أن الإشعاع فوق البنفسجي للخلايا المضيفة يمنع تكوين مركب النسخ المتماثل المستقر ، في حين أنه لا يمنع λ تكرار الحمض النووي [65]. يمكن تشكيل مجمعات النسخ المستقرة في المشعة فوق البنفسجية recA المسوخ [65] مما يوحي بأن استجابة SOS ، بدلا من الأشعة فوق البنفسجية في حد ذاته، مسؤول عن التغييرات في عملية التجميع المعقد للنسخ المتماثل. ومن المثير للاهتمام ، أن تعرض البكتيريا للأشعة فوق البنفسجية لم يؤثر على استقرار مجمع النسخ المتماثل الذي تم تجميعه قبل التشعيع [65]. تشير هذه النتائج إلى أن مركب النسخ المتماثل المستقر (الموروث) ، على الرغم من حساسيته للصدمة الحرارية ، يقاوم بعض الضغوط البيئية الأخرى ، مثل الصدمة الباردة (انظر الفقرة السابقة) أو العوامل التي تسبب تلف الحمض النووي.

يوحي التكاثر الفعال لـ λ DNA في ظل ظروف النمو الطبيعية وفي الخلايا المشعة بالأشعة فوق البنفسجية أن تكوين نوعين على الأقل من مجمعات النسخ المتماثل ممكن. يمكن تجميع المركب المستقر (القابل للتوريث) في ظل ظروف نمو طبيعية ويمكن تجميع معقد غير مستقر (على الرغم من أنه لا يزال يعمل لبدء النسخ المتماثل الفردي) في خلايا مشعة بالأشعة فوق البنفسجية. ومن المثير للاهتمام ، اختلافات كبيرة في بدء تكرار الحمض النووي من أوري λ بين الخلايا المزروعة في ظل ظروف نمو طبيعية وبعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية تم الإبلاغ عنها سابقًا [66]. عادة ، أوري يجب أن تكون المنطقة تحت التوتر فوق الحلزوني لتكون ركيزة مناسبة لآلية بدء النسخ المتماثل [19 ، 20]. لذلك ، بمجرد إجراء جولة من التكرار ، الابنة أوري متواليات لن تكون تحت مثل هذا التوتر ، وبالتالي ستكون غير نشطة. ومع ذلك ، في البكتيريا المشعة بالأشعة فوق البنفسجية ، هناك حاجة إلى ملفوفة فائقة الأصل يبدو أن المنطقة لبدء النسخ المتماثل قد تم تخفيفها ، مثل إعادة بدء النسخ المتماثل منها أوري لوحظت جزيئات داوجثر المريحة ، التي لا تزال تتكاثر ، [66]. قد تدعم هذه النتائج الفكرة المقدمة أعلاه والتي يمكن أن يعمل فيها نوعان مختلفان على الأقل من مجمعات النسخ المتماثل بشكل فعال أوري λ.

بعض الدراسات الحديثة حول تكرار البلازميدات الأخرى تحت ضغوط مختلفة

تم وصف البلازميدات المشتقة من العاثيات λ في هذه المقالة كنماذج في دراسات حول تأثيرات ظروف الإجهاد على تنظيم تكرار العناصر الوراثية خارج الصبغيات. ومع ذلك ، فمن الواضح أن استجابات الإجهاد الخلوي تؤثر بشكل كبير على تكرار معظم ، إن لم يكن كل ، أنواع البلازميدات. على سبيل المثال ، على غرار λ النسخ المتماثلة ، تتطلب العديد من البلازميدات وظائف بروتينات الصدمة الحرارية [1]. تمت مراجعة الجوانب البيوكيميائية لمتطلبات بروتينات الإجهاد المختلفة لتكرار البلازميدات المختلفة مؤخرًا [1-6] ، ولن تتم مناقشتها بالتفصيل هنا. ومع ذلك ، ما زلنا بعيدين عن الفهم الكامل للعمليات التنظيمية التي تتحكم في تكرار البلازميدات المختلفة في ظل ظروف الإجهاد. فيما يلي نناقش بإيجاز بعض الدراسات الحديثة التي عالجت هذه المشكلة وأضفت معلومات مهمة إلى معرفتنا التي لا تزال غير مكتملة حول فسيولوجيا البلازميد.

تم التحقيق في تكرار العديد من البلازميدات (مشتقات من النسخ المتماثلة التي تشبه ColE1 ، و pSC101 ، و R1 ، و RK2 ، و R6K ، و F ، و phage P1 المشتقة من البلازميدات) في الخلايا البكتيرية المتعطشة للأحماض الأمينية. تمت مراجعة هذه الدراسات مؤخرًا بالتفصيل [67] وهنا سيتم تلخيصها بشكل موجز فقط. في معظم الحالات ، لوحظ تثبيط تكاثر DNA البلازميد في الخلايا البرية المتعطشة للأحماض الأمينية. ومع ذلك ، لوحظت ظواهر مختلفة أثناء الاستجابة المريحة ، أي تم منع تكرار بعض النسخ المتماثلة في تجويع الأحماض الأمينية. ريلا المسوخ ، بينما استمر تكرار النسخ المتماثلة الأخرى بكفاءة في ظل هذه الظروف. أدى هذا النسخ المتماثل إلى تضخيم البلازميدات في البكتيريا. ومن المثير للاهتمام ، أن كفاءة تكرار الحمض النووي البلازميدي أثناء الاستجابة المريحة تعتمد في كثير من الحالات على طبيعة نقص الأحماض الأمينية (لمزيد من التفاصيل ، انظر المرجع [67] والمراجع الواردة فيه). اقتراحات حول الآليات التنظيمية الممكنة للتحكم في النسخ المتماثل لبعض البلازميدات في الأحماض الأمينية المتعطشة ريلا تم عرض المسوخ [67].

لقد تم إثبات أن البلازميد pSY10 الموجود في البكتيريا الزرقاء البحرية التي تنتمي إلى الجنس المكورات المتزامنة، يتم الاحتفاظ بها عند عدد نسخ مرتفع عندما تنمو الخلايا المضيفة في مياه البحر وبعدد نسخ منخفض في الخلايا المستزرعة في المياه العذبة [68]. لذلك ، يجب أن يعتمد تنظيم تكرار هذا البلازميد على ملوحة البيئة. كشفت تجارب أكثر تفصيلاً أن نسخ ملف ريبا الجين ، الذي يرمز للبروتين البادئ لتكاثر البلازميد ، ينخفض ​​في الخلايا التي تنمو في المياه العذبة بالنسبة للبكتيريا الزرقاء المستزرعة عند الملوحة العالية [68]. علاوة على ذلك ، فإن القامع المفترض لـ اعادة عد تم اكتشاف محفز الجينات ، ووجد أن هذا البروتين يتم تصنيعه فقط عند الملوحة المنخفضة [68]. هذا البروتين ، الذي يتم ترميزه بواسطة الكروموسوم المضيف ، هو مرشح ممتاز للمنظم الرئيسي لتكرار pSY10 استجابة للتغيرات في ملوحة البيئة.

تقوم بعض البلازميدات بتشفير بروتينات الإجهاد الخاصة بها. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن جينات بروتينات الصدمة الحرارية الصغيرة من البلازميدات pER16 و pER35 و pER36 ، والتي تحدث بشكل طبيعي في العقدية الحرارية سلالات [69]. تعزز هذه البروتينات قابلية بقاء البكتيريا في البيئات القاسية ، وقد اقترح أن وجود بروتينات الصدمة الحرارية المشفرة بالبلازميد قد يعزز بقاء الخلايا في ظل ظروف معينة.

لوحظت تأثيرات مشتركة مثيرة للاهتمام لارتفاع درجة الحرارة والإنتاج عالي المستوى للبروتينات المؤتلفة على تكرار البلازميدات الشبيهة بـ ColE1 [70]. وبالتحديد ، في ظل الظروف التي تسبب عادةً تضخيم دنا البلازميد في درجات حرارة متزايدة ، فإن الإفراط في التعبير المتزامن للبروتينات المؤتلفة التي تشكل أجسامًا متضمنة يخفف تضخيم DNA البلازميد [70]. في الواقع ، تأثيرات الإنتاج المحسن للبروتينات المؤتلفة على استقرار البلازميدات الشبيهة بـ ColE1 في بكتريا قولونية تم الإبلاغ عن سلالات سابقًا [71] ، وكشفت المزيد من الدراسات الحديثة أن خصائص البروتينات المؤتلفة المنتجة في البكتيريا تؤثر على كفاءة صيانة البلازميد [72]. الآليات الجزيئية لهذه اللوائح لا تزال بحاجة إلى توضيح.

كما نوقش أعلاه ، على عكس البلازميدات المشتقة من bacetriophage λ (انظر الفقرات السابقة) ، يتسبب ارتفاع درجة الحرارة في تضخيم البلازميدات الشبيهة بـ ColE1 [70]. زيادة معدل بدء تكاثر الكروموسومات الجرثومية في ظل هذه الظروف كما لوحظ سابقا [73]. أظهرت الدراسات الحديثة أن هذا النسخ المتماثل للكروموسوم الناتج عن الحرارة يبدأ في oriC (الموقع الطبيعي لبدء النسخ المتماثل النووي) ويتطلب بروتينات RNaseH1 و RecA ولكن ليس نشاط بوليميريز RNA و من جديد تخليق البروتين [74]. تم اقتراح أن هذه الظاهرة يمكن تفسيرها من خلال التغيير الحراري الديناميكي الناتج عن الحرارة oriC بنية و / أو سيولة الغشاء [74].

كما ذكرنا في الفقرات السابقة ، فإن الإفراط في التعبير عن الجينات المؤتلفة قد يمنع تكاثر البلازميد DNA [70]. قد يكون هذا التثبيط هو إشارة التحفيز للاستجابة الخلوية SOS [75]. في الواقع ، قد يتم تحفيز استجابة SOS بواسطة بروتين واحد مشفر بالبلازميد ، على سبيل المثال بروتين بادئ النسخ المتماثل للبلازميد pSC101 ، RepA [76]. تم اقتراح أن مثل هذا الحث على استجابة SOS قد يكون مفيدًا في الكشف عن عدم التوازن بين المستوى الخلوي لبروتين RepA ومواقع ربط RepA المحمولة بالبلازميد [76]. يجب أن تؤدي هذه الآلية إلى تثبيط النسخ المتماثل لكروموسوم المضيف ويجب أن تؤخر انقسام الخلية المضيفة عندما يكون RepA زائدًا نسبيًا. قد يساعد هذا في الحد من الاختلاف في عدد نسخ البلازميد ومنع تكوين خلايا بلا بلازميد.


اقتران الفوعة البلازميد في السريرية الكلبسيلة الرئوية سلالات من خلال تكوين الانصهار البلازميد

الانتشار السريع للبلازميدات الفوعة غير المقترنة بين أنواع غير K1 / K2 من الكلبسيلة الرئوية يشكل تهديدًا غير مسبوق لصحة الإنسان ، ومع ذلك فإن الآليات الأساسية التي تحكم انتشار مثل هذه البلازميدات غير واضحة. في هذه الدراسة ، تم اكتشاف بلازميد جديد بقيمة 68581 زوجًا أساسيًا من IncFIA والذي يمكن دمجه مع بلازميد مشفر لفرط الفوعة لتشكيل بلازميد هجين مقترن ضراوة في تجارب الاقتران مثل أحداث الاندماج التي تتضمن إعادة تركيب متماثل بين منطقة متجانسة 241 نقطة أساس في كل من اثنين من البلازميدات. يمكن ربط بلازميد الترميز المفرط للانصهار مع كلا من كلاسيكيات و بلوخKPC-2- تحمل مقاومة كاربابينيم K. الرئوية سلالات من خلال الاقتران ، مما يتيح لمثل هذه السلالات اكتساب القدرة على التعبير عن النمط الظاهري لفرط الفوعة. إن نشر بلازميد الفوعة الاندماجي هذا سيفرض عبئًا هائلاً على الجهود الحالية للسيطرة على العدوى التي تسببها المقاومة للأدوية المتعددة وفائقة الضراوة وعلاجها. K. الرئوية.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


متى يجب استخدام البلازميد الصارم؟ - مادة الاحياء

هل يجب أن أستخدم IRES أو 2A في كاسيت التعبير متعدد الألوان؟

عند تصميم ناقل التعبير الجيني للمشاركة في التعبير عن العديد من ORFs تحت سيطرة مروج واحد ، يمكنك اختيار وضع ORFs متعددة خلف المروج ، مفصولة بروابط مثل موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES) أو ببتيدات عائلة 2A. بالنسبة لأي نوع من الروابط ، سيتم إنتاج بروتينات متعددة من نسخة مرنا واحدة.

آليات

يُشتق عنصر IRES الأكثر استخدامًا ، وكذلك العنصر الذي تستخدمه VectorBuilder ، من فيروس التهاب الدماغ والعضلات القلبية (EMCV). يعمل من خلال العمل كموقع توظيف إضافي للريبوسوم ، مما يسمح ببدء الترجمة في منطقة داخلية من mRNA بالإضافة إلى موقع بدء الترجمة الأساسي.

الببتيدات 2A قصيرة (

18-25 أأ) الببتيدات المشتقة من الفيروسات. غالبًا ما يطلق عليهم اسم الببتيدات & ldquoself-cleaving & rdquo ، والتي ستنتج بروتينات متعددة من نفس النسخة. 2A الببتيدات لا تنكسر بالكامل ، & rdquo لأنها تعمل عن طريق جعل الريبوسوم يتخطى تخليق رابطة ببتيد الجلايسين والبرولين في الطرف C- الطرف لعنصر 2A ، مما يتسبب في الفصل بين نهاية تسلسل 2A والببتيد المصب . نتيجة لذلك ، سيحتوي بروتين المنبع على عدد قليل من بقايا 2A الإضافية تضاف إلى نهايته C بينما يحتوي البروتين المتجه إلى المصب على برولين إضافي يضاف إلى نهايته N. هناك أربعة ببتيدات 2A شائعة الاستخدام ، P2A ، T2A ، E2A و F2A ، مشتقة من أربعة فيروسات مختلفة.

إيجابيات وسلبيات نوعي الروابط

الميزة الرئيسية لـ IRES فوق 2A هي أنها لا تؤثر على تسلسل البروتين في المنبع أو المصب ORF ، وهذا ليس هو الحال بالنسبة 2A.

العيب الرئيسي لـ IRES هو أن المصب ORF في IRES يتم التعبير عنه بمستويات أقل بكثير (عادةً 10-20 ٪) مقارنةً بـ ORF المنبع في polycistron. هذا هو السبب في أن الأشخاص عندما يعبرون عن البروتينات الفلورية بعد IRES ، غالبًا ما يواجهون مشكلة في الحصول على إشارة مضان قابلة للاكتشاف ، خاصة للتطبيقات في الجسم الحي حيث يوجد عدد محدود من الجينات المحورة لكل خلية. يمكن أن تكون عناصر IRES أيضًا مشكلة نظرًا لحجمها (& gt500 bp) ، مما يزيد من صعوبة إنشاء ناقلات وتعبئة الفيروسات.

الميزة الرئيسية لـ 2A على IRES هي أنه يمكن التعبير عن ORF في المصب بمستوى مماثل (أو أقل بشكل معتدل من) ORF المنبع.

يتمثل عيب 2A في إمكانية حدوث تأثيرات بيولوجية غير مرغوب فيها لبقايا الببتيد الإضافية المتروكة في المنبع أو المصب ORF. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الانقسام الذاتي 2A ليس فعالًا بنسبة 100 ٪ ، ويمكن أن تتأثر الكفاءة بشدة بسياق التسلسل في المنبع والمصب ORF. على هذا النحو ، يمكن أن يكون جزء كبير من منتج الترجمة من البولييسترون عبارة عن بروتين اندماج فشل في الانصهار الذاتي ، وهو ما قد يكون مصدر قلق في بعض التطبيقات.

إذا كانت تجاربك لا تتطلب تعبيرًا عالي المستوى عن ORF الثاني للبيسترون (على سبيل المثال ، علامة اختيار الدواء) ، فيجب أن تكون IRES كافية. ومع ذلك ، إذا كان هناك أكثر من اثنين من ORFs في polycistron ، أو إذا كان من المهم التنبؤ أو كمية متساوية من ORFs المتعددة المعبر عنها بشكل مشترك ، فإننا نقترح استخدام 2A الببتيدات.

مقارنة ببتيدات 2A مختلفة

من بين أربعة ببتيدات 2A شائعة الاستخدام (P2A و T2A و E2A و F2A) ، يظهر أن P2A تتمتع بشكل عام بأعلى كفاءة انقسام (ما يقرب من 100٪ في بعض الحالات). يأتي T2A بعد ذلك ، يليه E2A و F2A. كفاءة الانقسام في F2A حوالي 50٪ فقط. نوصي بشكل عام باستخدام P2A أو T2A في polycistrons.


شاهد الفيديو: moleculer cloning بالعربى (ديسمبر 2022).